易基因：基于亚硫酸盐测序的交集时钟揭示人类胚胎发生过程中年轻化事件

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最近的研究揭示了小鼠的早期发育过程中的年轻化事件（rejuvenation event）。本文通过检测人类胚胎发生过程中的表观遗传年龄动态变化，分析人类是否也存在类似事件。为此，研究人员开发了一种表观遗传时钟方法——交集时钟（intersection clock），该方法利用亚硫酸盐测序，最大限度利用信息丰富的CpG位点，并确保检测样本中没有缺失的时钟CpG位点，将其应用于人类胚胎发育数据。分析结果表明，在卵裂期和囊胚期胚胎之间预测的表观遗传年龄没有变化；然而在囊胚和代表外胚层的细胞之间观察到表观遗传年龄显著下降。通过将交集时钟应用于跨越植入前和植入后的数据集，结果揭示了在植入前阶段的表观遗传年龄没有显著变化；而植入后样本的表观遗传年龄较低。进一步研究了primed（重编程细胞，早期植入后阶段）和naïve（未重编程细胞，植入前阶段）诱导多能干细胞（iPSCs）的表观遗传年龄，并观察到在所有情况下，primed细胞的表观遗传年龄显著低于naïve细胞。总的来说，本研究数据分析表明人类胚胎在早期胚胎发生过程中经历了年轻化。因此，年轻化事件在小鼠和人类之间是保守的，且在两个物种中都发生在原肠胚形成（gastrulation）阶段。此外，本研究的交集时钟为基于人类亚硫酸盐测序数据集的其他表观遗传年龄研究开辟了道路。

背景

生殖细胞系在成年生活中会经历与年龄相关的变化。有人提出，在受精后的后代中生殖细胞可能会经历年轻化。研究人员基于这一想法进行基于数据的测试，应用表观遗传时钟来追踪生物年龄（即基于分子标记的年龄）的变化，并揭示了小鼠胚胎发生早期的年轻化事件。结果表明，胚胎第6.5/7.5天样本的平均表观遗传年龄与胚胎发生早期阶段相比始终较低，使用不同的概率时钟（scAge）进行单细胞分析也显示了类似模式。这个胚胎时期大约对应于原肠胚形成。然而，人类是否存在类似的年轻化事件仍然是一个未解的问题。为此，研究人员评估了人类早期胚胎发生过程中的表观遗传年龄动态变化。

表观遗传时钟基于CpG位点的甲基化水平，是生物年龄的有前景的分子估计器。这些时钟可以定量分析人类衰老的多个方面。尽管有多种基于人类甲基化阵列的表观遗传时钟可用，但基于人类亚硫酸盐测序的老化时钟尚未开发。这可能是因为直到最近，还没有可用的亚硫酸盐测序数据（具有足够数量的年龄metadata的样本）适合用于训练（training）表观遗传时钟。

分析结果：

为了评估人类胚胎发生的表观遗传年龄动态变化，需要基于人类亚硫酸盐测序数据的表观遗传时钟方法，因为只有这种类型的数据对人类胚胎可用（表S1）。因此开发了一种新的表观遗传时钟方法，即“交集时钟”（图1），并使用182个人类血液样本的可用简化还原性亚硫酸盐测序（RRBS）数据进行训练（表S1中的数据集1，图S1）。交集时钟针对亚硫酸盐测序数据进行优化，其中训练集和测试数据集之间重叠的CpG位点数量不足，无法进行可靠预测。交集时钟最大限度利用在测试样本中没有丢失时钟CpG位点的信息性CpG位点。通过在训练数据集和测试样本数据之间的交集CpG位点上进行训练和测试来预测测试样本的年龄。因此，交集时钟方法保证在测试样本中没有丢失的时钟CpG位点。尽管这种方法需要为每个数据集训练新的表观遗传时钟，但它最大程度提高了这些数据集的效用。

表S1：本研究中使用的胚胎 DNA 甲基化数据集和样本，从可用的数据集中选择了人类RRBS/WGBS批量样本。

DCM：扩张型心肌病；ES细胞：胚胎干细胞；GW：妊娠周；HNES细胞：人类幼稚胚胎干细胞；iPSCs：诱导多能干细胞；MII卵母细胞：中期II卵母细胞；P：通道；PSCs：多能干细胞；RRBS：减少代表性亚硫酸盐测序；WGBS：全基因组亚硫酸盐测序。

图1：交集时钟工作流程示意图。对每个测试样本进行表观遗传年龄预测，工作流程如下：

确定训练数据集和测试样本之间CpG位点的交集。
将训练集和测试样本限于交集CpG位点。
对训练集（交集训练集）和测试样本（交集测试样本）进行模型的训练和测试。
对交集训练集进行五次交集验证，产生了五个交集时钟模型（例如ElasticNet模型）。
计算五个模型的预测结果平均值，生成样本的预测（表观遗传）年龄。

补充图S1：按条件、性别和年龄分列的182个训练样本（人类血液）的分布情况。

SA：自杀未遂者；MDD：重度抑郁症。

为了评估胚胎发生过程中的表观遗传年龄动态变化，收集可用的人类DNA甲基化（DNAm）数据集（数据集2-4），并使用交集时钟进行分析。交集时钟对仅限于交集CpG位点训练集上的交集验证中表现出高性能（图2a-c）。数据集2中的一项研究使用RRBS生成了人类植入前发育和胚胎干细胞（代表人类外胚层）的全基因组甲基化图。研究人员处理了包括精子、卵裂、囊胚和人类胚胎干细胞（ES）细胞在内的所有人类样本的甲基化水平，观察到卵裂期和囊胚期胚胎的预测表观遗传年龄之间没有显著变化（p = 0.7378）；囊胚和ES细胞的表观遗传年龄显著下降（p=1.582e-12）（图2e）。小鼠外胚层（E6.5）与人类ES细胞之间的跨物种比较表明，这些ES细胞是人类外胚层的合理替代物；因此数据表明，人类植入后外胚层的表观遗传年龄也低于植入前阶段的表观遗传年龄。进一步将交集时钟应用于另外两个数据集（数据集3和4），其中包含植入前（受精卵、卵裂、桑椹胚和囊胚）和植入后（GW 6-11肝脏和绒毛）样本。观察到植入前阶段之间没有显著变化；但植入后样本的表观遗传年龄显著下降（图2f，g）。总的来说数据表明人类胚胎在早期胚胎发生期间年轻化。

图2：交集时钟揭示人类早期胚胎发生期间的年轻化事件。

(a-d、i、k、m) 交集CpG位点数量和交集验证（CV）模型性能：图表展示交集时钟在不同数据集（Datasets2–8）上的交集CpG位点数量以及交集验证模型的性能。性能通过Pearson相关系数（r）和平均绝对误差中位数（MedAE）评估。每个点代表一个测试样本，CV性能在交集CpG位点的训练集（Dataset1）中分析。

(e-g) 不同人类发育阶段样本的平均预测年龄（表观遗传年龄）：图表显示交集时钟对不同人类发育阶段样本（来自Datasets2–4）的平均预测年龄。在数据集2中，ES细胞代表植入后外胚层。

(h) 图表展示交集时钟对健康对照组和扩张型心肌病患者的纤维细胞及其衍生的诱导多能干细胞（iPSCs）（来自Dataset5）的平均预测年龄。

(j、l、n) 图表展示交集时钟对不同数据集（Datasets6–8）的naïve细胞（重置细胞、HNES1细胞）和primed（常规PSCs，primed HNES1细胞，代表植入后外胚层）胚胎干细胞（ESC）样本的平均预测年龄（表观遗传年龄）。

为了进一步验证该方法分析年轻化事件的能力，将交集时钟应用于人类诱导多能干细胞（iPSCs）数据集（Dataset 5）。结果表明，成年对照组（p=0.0136）和扩张型心肌病患者（2.679e-05）的成纤维细胞重编程后，表观遗传年龄显著下降（图2d、h）。

数据集2-4不仅包含胚胎数据，还包括精子数据，在数据集3中还包括MII卵母细胞样本。将交集时钟应用于这些样本的甲基化谱，发现精子细胞的表观遗传年龄在某些情况下低于植入前阶段：在数据集2和3中的差异显著（图2e、f），而在数据集4中的差异不显著（图2g）。此外，人类MII卵母细胞和植入前胚胎之间的表观遗传年龄没有显著差异（图2f），尽管精子细胞的表观遗传年龄显著低于MII卵母细胞。目前尚不清楚雄性生殖细胞在配子发生过程中是否也会经历年轻化。

无论是来源于囊胚还是通过重编程生成的常规人类多能干细胞（PSCs），都与小鼠胚胎干细胞不同，代表了多能性的发育晚期或启动阶段。通过体外重置常规PSCs或直接从ICM捕获细胞开发了多种方法来生成更接近原始表型的PSCs。通过将交集时钟应用于数据集6-8，primed（代表早期植入后）和naïve（代表植入前）PSCs的表观遗传年龄，并观察到在所有情况下，primed细胞的表观遗传年龄显著低于naïve细胞（图2i-n）。

总之，这些数据支持了年轻化事件发生在人类早期胚胎发育期间的假设。

DISCUSSION

本研究结果重现了在小鼠中的发现，发现胚胎第6.5/7.5天样本的表观遗传年龄与早期胚胎发生阶段相比始终较低。因此，胚胎年轻化事件在小鼠和人类之间保守，并且在两个物种中都发生在胚胎发育的原肠胚形成阶段。数据支持人类胚胎发生过程中实现对应于生物体最低生物学年龄的“归零（ground zero）”模型。随着对“ground zero”认识的不断发展，可能会改变对人类生物体生命开始的看法。

在某些情况下，精子细胞的表观遗传年龄低于MII卵母细胞和植入前阶段胚胎。本研究分析了胚胎年轻化，但目前尚不清楚生殖细胞发育和配子发生是否也与年轻化有关，需要进一步研究来阐明这一点。

在唯一可用的潜在训练数据集（数据集1）中，最年长的健康患者是40岁，而年长患者表现出不良的健康表型（SA或MDD，图S1）。尽管最初研究揭示了健康组与SA组、健康组与MDD组之间的甲基化谱存在显著差异，但至少部分差异可能是由于健康组与SD/MDD组之间的平均年龄差异所致。同样可能的是，区分健康组和SD/MDD组的CpG位点与表观遗传时钟使用的CpG位点不同。总的来说，在这种情况下，使用所有数据进行训练过程是合理的。

先前基于甲基化芯片的人类iPSCs表观遗传年龄评估显示，在重编程过程中表观遗传年龄下降（即年轻化）。本研究基于人类亚硫酸盐测序数据验证了这些结果（图2h），并表明交集时钟可以检测到年轻化。

人类胚胎的全基因组CpG甲基化在植入前发育期间从受精卵到囊胚阶段逐渐减少，随后在植入后胚胎（代表性primed PSCs）中全基因组CpG甲基化增加。相比之下，植入前发育期间（受精卵、卵裂、桑椹胚和囊胚阶段；图2e-g）表观遗传年龄没有显著变化，随后在植入后胚胎（代表性primed PSCs）中表观遗传年龄下降（图2e-g、j、l、n）。这些数据表明，DNA甲基化维持和de novo甲基化在年轻化事件中发挥作用，和之前在小鼠中的结果一致。

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简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，富集启动子及CpG岛等重要的表观调控区域并进行重亚硫酸盐测序。该技术显著提高了高CpG区域的测序深度，在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域可以获得高精度的分辨率，是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。

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技术优势：

起始量：100ng gDNA；
单碱基分辨率；
多样本的覆盖区域重复性可达到85%-95%、测序区域针对高CpG调控区域，数据利用率更高；
针对性强，成本较低；
基因组CG位点覆盖高达10-15M，显著优于850K芯片。

应用方向：

RRBS/dRRBS/XRBS广泛应用于动物，要求全基因组扫描（覆盖关键调控位点）的：

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复杂疾病及肿瘤发病机制等甲基化研究
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参考文献：

Kerepesi C, Gladyshev VN. Intersection clock reveals a rejuvenation event during human embryogenesis. Aging Cell. 2023 Oct;22(10):e13922. doi: 10.1111/acel.13922. PubMed PMID: 37786333.

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