Nat Med | 癌症肿瘤、免疫和微生物组综合图谱

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今天给同学们分享一篇实验文章“An integrated tumor, immune and microbiome atlas of colon cancer”，这篇文章发表在Nat Med期刊上，影响因子为82.9。

结果解读：

AC-ICAM 概述

新鲜冷冻的肿瘤样本和配对的健康结肠组织（肿瘤-正常对）来自未接受全身治疗的具有结肠癌组织学诊断的患者，通过正交基因组平台进行了分析。在交叉平台质量控制（基于全外显子测序（WES）和RNA-seq数据）和纳入标准检查后，保留了来自348名患者的基因组数据，并用于下游分析（图1a和扩展数据图1a，b；方法提供了更多细节）。中位随访时间为4.6年。作者将此资源称为Sidra-LUMC AC-ICAM：免疫-癌症-微生物组相互作用的图谱和指南。

ICR超越了传统的分子分类方法

一个模块化的免疫基因签名，捕捉到癌症免疫监视的连续性，被称为免疫排斥的恒定（ICR）。作者随后对其进行了优化和压缩，形成了一个固定的20基因面板，在不同类型的癌症中显示出预后意义（例如，黑色素瘤、膀胱癌、乳腺癌、神经母细胞瘤和软组织肉瘤）。ICR还与多种癌症类型对免疫治疗的反应相关，包括乳腺癌、黑色素瘤和非小细胞肺癌。ICR签名包括反映T1细胞信号通路激活、CXCR3/CCR5趋化因子配体表达、细胞毒性和免疫调节机制的逆激活的基因模块（图1b）。

作为第一个目标，作者对AC-ICAM队列上的ICR签名进行了验证。这个目标在数据生成之前就预先定义好了（前瞻性验证回顾性收集的样本；方法提供了详细信息）。基于ICR基因的共识聚类方法（扩展数据图2a、b）将队列分为三个聚类/免疫亚型：ICR高（热瘤）、ICR中和ICR低（冷瘤）（图1b）。使用103个先前定义的免疫特征（方法）进行系统转录组分析，将这些特征共聚成七个不同的模块（M1-M7）（扩展数据图3），其中ICR属于M2（淋巴细胞浸润特征），与其他免疫特征一起，包括肿瘤炎症特征。然后，作者根据共识分子亚型（CMS）对免疫状态进行了表征，CMS是结直肠癌的一个明确定义的转录组分类，包括CMS1/免疫型、CMS2/经典型、CMS3/代谢型和CMS4/间质型。总体而言，整个表达数据的t分布随机邻域嵌入（t-SNE）图表将CMS1-CMS3样本分开，但CMS4表现出高度的异质性（扩展数据图2c，左图）。在CMS亚型中，ICR变化很大（扩展数据图2c，右图）。虽然大多数CMS1样本的ICR值较高，表明免疫活化，但CMS4样本分布在三个ICR免疫亚型之间。根据解剖位置，右侧结肠富集CMS2，而左侧结肠贫乏CMS1（扩展数据图2d）（扩展数据图2d）明显可见。ICR评分（20个ICR基因的平均值）和白细胞亚群富集评分显示，从右侧结肠到左侧结肠只有轻微的降低，ICR高在盲肠与直肠乙状结肠肿瘤中更为普遍。癌细胞相关通路的富集评分在CMS亚型之间明显不同（扩展数据图2e）。ICR得分与所有CMS亚型中的某些癌细胞通路呈负相关（例如，WNT-β连环蛋白和NOTCH信号通路），而与免疫抑制和基质相关的通路（例如，转化生长因子（TGF）-β、上皮间质转化和血管内皮生长因子信号通路）仅在CMS4肿瘤中观察到正相关（扩展数据图2f）。

ICR捕获富含肿瘤、克隆扩增的T细胞

据报道，浸润肿瘤组织的T细胞中只有少数是针对肿瘤抗原的特异性细胞（不到10%）。因此，大部分肿瘤内的T细胞被称为旁观者T细胞。作者随后试图解释为什么ICR（测量T细胞浸润和功能定向，而不考虑抗肿瘤特异性）具有如此强烈的预后意义。

所有样本（114个肿瘤和9个健康结肠组织）均通过immunoSEQ对TRB基因进行了专门的深度测序，以获得足够的DNA进行此项检测。TRB基因序列信息也从批量RNA-seq中使用MiXCR提取（n = 341） 30 。在基于RNA-seq测量的基质细胞和白细胞亚群中，具有有效TCR（immunoSEQ TCR有效DNA模板）的常规（αβ）T细胞数量与T细胞亚群的估计值（图2a）呈最强相关性，表明DNA和RNA基于测量的稳健性；然而，immunoSEQ TCR有效克隆性与ICR得分的相关性最强（r = 0.61），证实了ICR捕捉T细胞丰度之外的其他特征的能力（图2a，b）。尽管使用批量RNA-seq进行TCR库分析在灵敏度和特异性方面存在固有限制，但MiXCR TCR克隆性与immunoSEQ TCR克隆性（r = 0.64）以及ICR（r = 0.40）相关良好（图2b）。在ICR亚型中（整体和CMS类别内），immunoSEQ TCR克隆性在ICR高组和CMS1/免疫组中最高（图2c和扩展数据图4a），其中CMS亚型中ICR高肿瘤的比例最高（图1f）。使用整个转录组（18,270个基因），与TCR immunoSEQ克隆性呈正相关的前十个基因中有六个是ICR基因（IFNG，STAT1，IRF1，CCL5，GZMA和CXCL10）（图2d）。此外，与immunoSEQ TCR克隆性相关的前50个基因的网络以ICR的主要调节因子IRF1和STAT1为中心（图2e）。与肿瘤反应性CD8 T细胞标记物（通过单细胞测序方法定义）相比，immunoSEQ TCR克隆性与大多数ICR基因的相关性更强（图2f，g）。

与免疫反应较弱相关的体细胞改变

作者试图通过对281个肿瘤样本及其相应的健康组织进行WES（扩展数据图5a，b）来确定与癌细胞体细胞改变（如突变和拷贝数变异）相关的免疫应答驱动因素。

在体细胞突变方面，AC-ICAM数据集的肿瘤突变负荷（TMB）与TCGA-COAD队列高度相似（图3a），临床病理参数也相似。然而，与TCGA-COAD队列不同的是，作者研究中的样本选择不依赖于肿瘤纯度。事实上，与TCGA-COAD数据集相比，AC-ICAM中的基质和免疫含量（ESTIMATE评分）以及个体淋巴细胞亚群的浸润（图3b）显著增加，而癌细胞内固有特征的情况则相反。这与TCGA-COAD相比，AC-ICAM中的CMS1比例较低，ICR低比例较高相一致。虽然两个队列中观察到相同比例的MSI高（MSI-H）病例，但TCGA-COAD的MSI-H样本显示CD8 T细胞水平较低，这与选择较少免疫浸润的标本一致。作者随机选择了样本，并使用两种方法对队列进行了100次子采样：一种是随机的，另一种是在一个近似于TCGA-COAD ESTIMATE分布的样本子组中进行的。随机子采样导致Cox比例回归显示ICR评分相对于近似于TCGA-COAD ESTIMATE分布的采样方法在生存受益方面具有统计学显著性（P < 0.0001，卡方检验）的子集数量增加了三倍。这些发现表明，较低的免疫-基质浸润可能对生存分析产生影响，从而导致在TCGA-COAD中观察到的免疫特征与OS之间缺乏相关性。

基因免疫编辑优化了ICR的预后价值

然后，作者继续整合ICR和TMB数据。虽然高突变样本经常显示出ICR高表型，但相当比例的ICR高样本（46%）具有低TMB（图4a），这对ICR类别内外的OS没有影响（图4b和扩展数据图6a、b），与之前对免疫评分观察到的一致。

健康和结肠癌组织中的微生物组成

作者使用从246名患者的匹配肿瘤和健康结肠组织中提取的DNA对16S rRNA基因进行了测序（图5a；AC-ICAM246队列）。这个数据集被用于微生物组地标分析。对这些样本的一个亚组进行了全基因组测序（WGS，中位覆盖率76×）以进行技术验证（n = 167；图5b）。为了验证目的，一旦地标分析完成，作者分析了来自42个额外肿瘤样本的16S rRNA基因测序数据，这些样本没有匹配的正常DNA可用于此分析（在此称为ICAM42队列，另见图1a）。

将相同的丰度过滤器应用于AC-ICAM246和TCGA-COAD数据集后，AC-ICAM捕获了在TCGA-COAD中检测到的所有属，这两个队列中显示出几乎相同的共相关模式，还有其他几个属。

首先，作者比较了匹配的肿瘤和健康结肠组织之间的物种相对丰度。在门水平上，作者观察到肿瘤中的Fusobacteria显著增加，与健康样本相比（图5a），两种方法之间具有高度一致性（图5b）。在属水平上，如预期，Fusobacterium的变化最为显著（图5c和扩展数据图7a），其中主要由F. nucleatum代表（图5d）。作者的分析还捕捉到了几个在肿瘤或健康组织中高度富集的其他物种（虚假发现率（FDR）<0.05且折叠变化>2）（图5c）。在肿瘤和健康样本之间没有观察到α多样性（个体样本内物种的多样性和丰度）的主要差异（扩展数据图7b），只有在ICR高与ICR低肿瘤中观察到微弱降低的微生物多样性（扩展数据图7b）。Selenomonas和Selenomonas 3是在ICR高与ICR低肿瘤中最显著增加的物种（图5e，扩展数据图7c）。在生存分析方面，使用肿瘤数据（而不是健康结肠数据）和OS作为终点获得了最多的名义显著关联（扩展数据图7d）。

Fusobacterium和F. nucleatum的丰度与晚期 17 、BRAF突变的存在 43 、MSI-H状态 17,44 以及趋向更差的PFS生存（扩展数据图图8） 17 相关，这与之前的观察结果一致。与T细胞 44 的负相关不同，Fusobacterium或F. nucleatum的丰度与细胞毒性T细胞和NK细胞相关，并伴随着髓系标志物和信号的增加（例如CD68、TREM1和IL8标志）。与有利的结果缺乏关联可能是由于F. nucleatum通过结合和激活抑制性受体TIGIT 45 和CEACAM1（参考文献 46 ）或通过诱导IL-8介导的髓系激活 47 （扩展数据图图8）。

一个预测生存的微生物组特征（MBR分数）

为了检测微生物组与临床结果之间的相关性，作者旨在使用16S rRNA基因测序的属水平数据，作为作者里程碑式的微生物组分析（AC-ICAM246，n = 246，测试集）的一部分，识别出与生存预测相关的微生物组特征。在AC-ICAM246上，作者运行了一个多变量弹性网络OS Cox回归模型，选择了41个具有非零系数的特征（分类单元），与死亡风险有关（方法）。作者将这个分类单元列表及其相关系数称为MBR分类器（图5f）。通过应用MBR分类器，为每个样本分配了一个得分（MBR得分）。尽管某些分类单元相对于解剖位置的丰度存在变化，但MBR得分在不同解剖位置（肿瘤和健康样本中）显示出稳定性。

使用SparCC相关系数推断共丰度网络揭示了五个不同的类群亚型（扩展数据图9a）。在ICR高样本与ICR低样本或肿瘤与健康结肠样本中富集的类群显示出高共丰度（富集于C3），健康结肠或ICR低样本中富集的类群也是如此（富集于C1；扩展数据图9b）。根据MBR分类器，低风险和高风险的类群分布在不同的亚型中（扩展数据图9b）。仅基于网络分析确定的每个亚型所属属的累积丰度估计观察到的存活差异较小（扩展数据图9c）。仅有一个FDR <0.1的存活关联与C5相关（OS分析，P = 0.017，风险比（HR）1.6，高丰度与低丰度，FDR = 0.085）。C5由三个类群组成，包括一个MBR高风险属和没有MBR低风险属。总体而言，这些结果表明临床结果受微生物组多样性的影响，而MBR分类器可以捕捉到这种多样性。一致地，高α多样性与长期生存期相关，FDR < 0.05适用于所有α多样性估计（扩展数据图9d）。

由于Ruminococcus 2对MBR分类器的强大贡献，作者试图确定实际的Ruminococcus物种。在WGS数据中，Ruminococcus属主要由Ruminococcus bromii组成，它与Ruminococcus 2也有最强的相关性（图5g和扩展数据图10a）。通过PCR确认了R. bromii的存在，PCR与测序数据之间有很强的相关性（例如，WGS和PCR之间的一致性达到91%；扩展数据图10b、c）。

MBR评分的验证

在作者的训练队列（ICAM246，训练集）中，低MBR分数（MBR < 0，MBR低）与死亡风险显著降低（85%）相关（图（图5h））。作者在两个独立的测试队列（ICAM42和TCGA-COAD队列）中分别和合并验证了MBR低（风险）与延长OS的关联（图5h，i，测试队列）。最终MBR模型在测试队列上的表现低于训练集，这是机器学习模型的典型情况（扩展数据图10d）；然而，最终MBR模型在测试队列上的一致性指数与通过交叉验证在训练集上得到的最佳MBR模型的一致性指数相交集（扩展数据图10d），证实该模型能够很好地推广到新的（未知的）数据。

通过仅使用肿瘤内Ruminococcus 2（基于16S数据）或R. bromii的存在（基于PCR或WGS数据）检测到了一种类似但较不明显的死亡风险降低趋势（扩展数据图10e）。肿瘤内的Ruminococcus 2和MBR评分彼此之间强相关，在肿瘤和健康结肠组织中表现相似（图5j）。

微生物组与临床结果之间的关系指向了微生物组与肿瘤中发生的生物过程之间的相互作用。当将免疫特征值与MBR得分相关时，与MBR得分最强的（反向）相关性观察到捕获CD103 + 树突状细胞（DCs）的优势特征，其具有独特的抗原处理和呈递能力，可有效地将抗原交叉呈递给CD8 + T细胞（CD103 + ，平均特征（P = 0.003）和CD103 + 特征与CD103 − 特征比率（P = 0.001））（图6a） 49 。一致地，MBR分类器中包含的个体分类群与免疫特征之间的相关分析表明，在具有正MBR系数（死亡风险较高）的分类群中，与髓系特征呈正相关，与CD103 +/ − 比率呈负相关，而对于具有负MBR系数的分类群，则观察到相反的情况（扩展数据图10f）。