单细胞+Bulk+流式|思路清晰,衰老特征怎么验证单基因?

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今天给大家分享一篇JCR一区,单细胞的文章:PPARγ attenuates cellular senescence of alveolar macrophages in asthma-COPD overlap

  • 标题:PPARγ在哮喘-COPD重叠中衰减肺泡巨噬细胞的细胞衰老
  • 发表日期:2024年4月
  • 期刊:Respiratory Research
  • 影响因子:5.8
  • 中科院分区:医学2区
  • 小类:免呼吸系统2区

摘要

背景
哮喘-慢性阻塞性肺病(COPD)重叠(ACO)代表了一种复杂的情况,老年人中具有哮喘和COPD的共享临床和病理生理特征。然而,ACO的病理生理学尚未被探索。我们旨在确定ACO中的主要炎症细胞,检查这些细胞内的衰老,并阐明调节衰老的基因。

方法
进行生物信息学分析,以调查从ACO患者肺组织中获得的公共单细胞RNA测序(scRNA-Seq)数据集中的主要细胞类型和细胞衰老特征。在独立的队列研究“免疫机制严重哮喘”(IMSA)中进行了类似的分析,该研究包括来自支气管肺泡灌洗液(BALF)样本的大量RNA-Seq和CyTOF数据。

结果
对scRNA-Seq数据的分析显示,在ACO患者的肺组织中,单核细胞/巨噬细胞是主要的细胞类型,占分析的细胞的50%以上。ACO患者的肺单核细胞/巨噬细胞表现出较低的衰老普遍性,其定义为SenMayo的低富集分数和细胞衰老标志物的表达水平。有趣的是,对IMSA数据集的分析显示,在严重哮喘患者中也有类似的结果。他们也表现出较低的衰老普遍性,特别是在气道CD206+巨噬细胞中,同时伴有细胞因子表达的增加(例如,IL-4,IL-13和IL-22)。进一步的探索确定了肺泡巨噬细胞作为ACO中驱动细胞衰老的主要单核细胞/巨噬细胞亚型。与氧化还原、细胞因子和生长因子相关的差异表达基因被认为在调节ACO中肺泡巨噬细胞衰老中起作用。PPARγ(过氧化物酶体增殖物活化受体γ) emerge作为调节ACO中肺泡巨噬细胞衰老特征的主要调节因子之一。

结论
研究结果表明,巨噬细胞,特别是肺泡巨噬细胞中的衰老在ACO的病理生理中起着关键作用。此外,PPARγ可能代表一个潜在的治疗靶点,用于调节ACO中与衰老相关的过程。

关键词:ACO,哮喘,COPD,巨噬细胞,衰老,PPARγ。

结果


在ACO患者中,肺泡巨噬细胞是主要的细胞类型。

  • A,从ACO患者(n = 1)和非ACO患者(n = 2)的人类肺组织中生成的scRNA-Seq数据集中鉴定了总共12个细胞簇。
  • B,通过使用SingleR算法将(A)中的细胞簇进一步注释为不同的细胞类型。
  • C,热图表示(B)中每种细胞类型的顶级差异表达基因。
  • D,ACO和对照组中每种细胞类型的相对百分比。
  • E,通过使用Leiden算法在单核细胞/巨噬细胞中鉴定了总共7个簇。
  • F,通过使用Leiden算法在单核细胞/巨噬细胞中鉴定了总共7个簇。
  • G,热图表示(F)中每种细胞类型的顶级差异表达基因。
    对类别变量进行了卡方检验以进行比较。


ACO患者单核细胞/巨噬细胞中的细胞衰老减少。

  • A,肺单核细胞/巨噬细胞中AUCell富集的SenMayo衰老评分密度。
  • B,单核细胞/巨噬细胞中ACO组和对照组的分布。
  • C,ACO组和对照组中SenMayo衰老的富集评分。
  • D,ACO组和对照组中每种单核细胞/巨噬细胞亚型的相对百分比。
  • E,ACO组和对照组中每个细胞周期阶段的相对百分比。
  • F-G,ACO组和对照组中细胞衰老标志物CDKN1A(p21,F)和CDKN2A(p16,G)的表达。对类别变量进行了卡方检验以进行比较。对数值变量进行了Wilcox秩和检验以进行比较。 p <0.05被视为统计学显著性。


IMSA数据集中严重哮喘患者衰老普遍性较低。

  • A,通过重复的共识聚类分析,使用不同的k值(从2到5)在IMSA数据集中鉴定稳定和有意义的簇。
  • B,通过累积分布函数(CDF)鉴定一致且稳定的细胞衰老簇。
  • C,根据ssGSEA SenMayo衰老评分将两个簇分为衰老低和高组。
  • D-F,衰老聚类低组和高组中细胞衰老标志物CDKN1A(p21,D)、CDKN2A(p16,E)和增殖标志物MKI67(F)的相对表达。G,衰老聚类低组和高组中健康对照组(HC,n = 5)、轻度/中度哮喘患者(MMA,n = 17)和严重哮喘(SA,n = 16)参与者的相对百分比。对类别变量进行了Fisher确切性检验以进行比较。对2组之间的数值变量进行了Wilcox秩和检验。 p <0.05被视为统计学显著性。


气道CD206+巨噬细胞显示衰老普遍性较低但细胞因子增加。

  • A,密度散点图显示了用于细胞类型注释的标记物相对表达的分布。
  • B,使用表面标记基因的组合注释了总共7个不同的细胞簇。
  • C,衰老聚类低组和高组中每种细胞类型的相对百分比。
  • D,IMSA队列中衰老聚类低组和高组BAL液中细胞因子水平。
  • E,热图表示衰老聚类低组和高组CD206+巨噬细胞的细胞因子表达。基于Limma的多元线性回归用于衰老高组和低组之间丰度和表达的比较。 p <0.05被视为统计学显著性。


ACO患者肺泡巨噬细胞中的差异表达基因和途径。

  • A,所有单核细胞/巨噬细胞的轨迹估计的二维散点图。
  • B,通过Leiden匹配轨迹分析鉴定的细胞簇的分布。
  • C,通过组匹配轨迹分析,细胞层的分布。
  • D,常用于单核细胞/巨噬细胞的谱系标记物的相对表达。
  • E,通过FindMarkers鉴定的7个细胞簇中排名靠前的高表达标记基因。
  • F,Leiden簇1和其他簇之间的AUCell KEGG富集评分差异。
  • G,ACO组和对照组之间的SenMayo衰老评分差异。
  • H-I,ACO组和对照组中细胞衰老标志物CDKN1A(p21,H)和CDKN2A(p16,I)的相对表达。
  • J,代表与氧化还原酶、细胞因子和生长因子相关的基因在ACO组和对照组之间的差异表达的热图。
  • K,Leiden簇1中CDKN1A表达与差异表达基因和单核细胞/巨噬细胞谱系标记物之间的相关性。对比较两组之间的数值变量使用Wilcox秩和检验;对于计算缺失表达值之间的系数使用Pearson相关性。 p <0.05被视为统计学显著性。


PPARγ作为调节肺泡巨噬细胞细胞衰老的关键因素。

  • A,hdWGCNA分析确定了六个基因模块,重点关注Leiden簇1。
  • B,棕色模块与ACO组和对照组之间细胞衰老差异呈正相关。
  • C,具有高相关性的棕色模块中的前30个中心基因。
  • D-F,通过WikiPathways(D)、Reactome(E)和KCGG(F)鉴定了棕色模块中的不同途径。
  • G,由PySCENIC生成的得分值排名Leiden簇1的前10个特定调控元。
  • H,针对TRRUST数据库进行的棕色模块内的转录因子富集分析。

小结

  • 主要数据及方法:
TypesNotes
分析数据Bulk:GSE136587,FR-FCM-Z395(Flow Repository数据库)
单细胞分析方法Seurat标准流程;LibraR包差异分析;AUCell富集评分;hdWGCNA共表达网络;PAGA轨迹分析;PySCENIC转录因子后TRRUST作富集;
Bulk分析方法ConsensusClusterPlus一致性聚类;limma差异分析
CyTOF分析方法和scRNA大同小异,归一化用CATALYST,聚类用FlowSOM,diffcyt鉴定差异细胞丰度和细胞因子表达,然后还是limma找差异
可视化除了Py和R,GraphPad也用上了,然后R包:genekitr、ggVennDiagram、ComplexHeatmap这些

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