ISME | 亚热带森林慢性氮磷添加对土壤启动效应的微生物控制

摘要：

土壤启动效应（PE），定义为不稳定的碳(C)输入对土壤有机质分解的影响，已知会影响陆地生态系统中的碳储存。然而，长期营养添加，特别是在豆科和非豆科森林中，如何通过与养分（如氮和磷）有效性的相互作用影响PE仍不清楚。因此，我们从亚热带豆科和非豆科种植园中收集了土壤。我们添加了13个c标记的葡萄糖来研究背景土壤养分条件和微生物群落如何影响启动及其潜在的微生物机制。葡萄糖的添加增加了土壤有机质的分解，并促使所有土壤的正启动，无论优势覆盖树种或肥料处理。在非豆科土壤中，只有氮和磷的联合添加导致的正启动量高于对照。相反，与对照相比，固定氮豆科植物下的土壤对单独添加磷和联合添加NP的反应呈积极。利用dna稳定同位素探针、高通量定量PCR、酶分析和微生物C底物利用，我们发现PE阳性与微生物C利用的增加有关，同时伴随微生物群落活性、营养相关基因丰度和酶活性的增加。研究结果表明，土壤有效氮和磷效应对PE的平衡取决于根际微生物群落组成。此外，这些发现强调了植物及其共生微生物群落之间的相互作用对土壤启动的影响，并提高了我们对土壤PEs背后潜在微生物途径的理解。

实验方法：

研究地点位于中国南部合山国家森林生态系统野外研究站（112°50‘E，22°34’N）。该地区属温带季风气候，年平均降水量为1580毫米，其中80%发生在4月至9月。年气温约为22°C，范围从12.6°C（1月）到28.0°C（7月）。研究地点位于两种森林种植类型，主要是印度豆科植物（LP）和非豆科植物（NLP）。田间试验包括不添加养分的对照地块（CK），100 kg N ha 1年1（N），100kgPha1yr1（P），100 kg N和P ha 1年1P添加处理（NP）。我们对每个种植园的三个不同地点（街区）的10 m×10 m地块进行了处理。(S1).采用硝酸铵和磷酸二氢钠进行加处理，每两个月喷洒一次。为了保持样地间用水量的一致性，CK样地在添加养分处理时接受了10 L的水。从每个小区上部20 cm土壤层随机采集10个土壤样品，均匀混合成一个复合土壤样品。以这种方式，共采集了24个（4个养分处理×2个种植园×3个重复）的土壤样品。

S1

孵化实验将土壤样品调整到40%的持水能力，然后在孵育实验开始前，在气候控制室（~22°C）中预孵育一周，以允许在采样和筛分干扰后沉降。每次处理的预培养土壤称重，分成8个等份，每份40克，然后放入50 mL小瓶中。然后将小瓶放在2L带盖的顶空角中。总共有48个顶空室，每个室包含8小瓶（4个营养处理×2种植园×3个重复×2平行）。pe是通过将含有溶解的13c-葡萄糖的脱盐纯净水加入到小瓶中（以下称为葡萄糖处理）来计算的。这导致C添加~450µg C/g新鲜土壤，相当于所有土壤样品的平均微生物生物量C。控制瓶接受等量的脱盐水净化水（以下称为对照）。所有的顶空室都在~22°C的气候控制房间的黑暗中孵化，匹配现场的年平均温度。培养0、6、18、42、66、114和162 h后，测定土壤呼吸和可用氮含量。在培养结束时，测定了土壤C底物的利用、微生物生物量、磷脂脂肪酸和潜在的酶活性。(S2).

S2

土壤呼吸和启动效应。在每个时间点（0、6、18、42、66、114和162 h），从顶空中取出一个小瓶进行分析。从顶空腔中取出后，将小瓶放入装有导管的1升密封瓶中。在用盖子关闭瓶子之前，用无二氧化碳的空气清洗了顶空。根据获得足够的二氧化碳所需的时间，这些瓶子在22°C的黑暗中孵育5-24 小时。然后，将气体收集到安全气囊中，使用Picarro G2201-i分析仪（Picarro公司，CA）测量co2浓度及其同位素组成（13C/12Cratio）。由SOM和葡萄糖释放出来的二氧化碳计算。

土壤性质和微生物生物量。在培养前测量了初始的土壤性质。土壤pH采用组合玻璃电极计（五pH FE28，瑞士梅特勒托莱多），以土壤和水浆的比例为1：5的比例测定。土壤有机碳（SOC）、土壤总氮（TN）、土壤无机氮（IN）、土壤总磷（TP）和土壤有效磷（AP）浓度按照前面所述的[44]方案确定。采用氯仿熏蒸法[45]测定微生物生物量C（MBC）和N（MBN）浓度。培养后，首先采用土壤PLFA方案[46]进行磷脂脂肪酸分析（PLFA）测定总微生物生物量，并对进行少量修改。根据GC-C-IRMS系统[3]测定的细菌和真菌生物标志物PLFAs的13c%，计算生物量中的微生物13C。

微生物DNA提取和超离心法。使用DNA提取试剂盒（MP生物医药，CA，Ana）从0.5 g土壤中提取土壤微生物DNA。使用MOBIO纯化试剂盒（卡尔斯巴德，CA，美国）进一步纯化该DNA。由于13C-DNA比12C-DNA重，所以采用超离心法分离13C-DNA比12C-DNA重。简单地说，将3.0 μg微生物dna溶解在1.85 g/mL氯化铯中，密度通过添加缓冲液（0.1 M pH = 8.0 Tris-HCl，0.1 M氯化钾，1.0 mM EDTA）或氯化铯调节。将制备好的DNA溶液转移到贝克曼超高速离心管中，由NTV-100垂直转子（贝克曼库尔特，帕洛阿尔托，美国）以177,000×g在20°C下离心44小时。离心后，使用固定速度泵（新时代泵系统公司，法明代尔，纽约，美国，美国）将DNA溶解液分离到13层。使用折射仪（赖法特公司，布法罗，纽约，美国）测量每个DNA层的折射率，并根据折射率计算DNA浮力密度。所有分离层DNA均用聚乙二醇6000沉淀法纯化，然后保存在冰箱中20 °C.

PCR扩增、DNA测序和高通量定量。PCR采用实时定量聚合酶链反应（qPCR）在CFX96光学实时检测系统（Bio-Rad，实验室公司，大力神，CA，美国）[47,48]上对每一层的DNA进行定量。预计标记DNA的密度约为1.725 g/ml[48,49]，因此，密度在1.69-1.75 g/ml之间的超离心DNA片段用于进一步测序和高通量定量PCR。用引物F515和R907 [50]扩增细菌16 S rRNA，真菌检测采用引物ITS1F和ITS2R [51]内部转录间隔区（ITS）。测序在上海马约比奥生物生物技术有限公司的HiSeq2000系统中进行。使用Trim Galore软件进行过滤，使用FLASH2软件进行拼接。利用QIIME2对16SrRNA数据库（SILVA v138）进行分类分析。我们遵循DADA2管道对优化序列进行去噪。采用智能芯片实时PCR系统（Wafergen，CA，USA）[52]，采用高通量qPCR检测涉及C、N和P循环的基因的丰度。该方案包含66对营养循环基因引物（包括35个c循环基因、22个n循环基因和9个p循环基因）和1个16 S rRNA基因引物（表S1）。PCR扩增程序遵循以下步骤。首先，将95°C初始变性10 min，然后在95°C下变性40次循环，然后在58°C下退火30秒，最后在72°C下延伸30秒。熔化曲线由WaferGen软件自动生成。基因的相对拷贝数计算为相对拷贝数= 10（31-CT）/（10/3），其中CT代表阈值周期。然后，将C-、N-和p-循环基因的相对丰度表达为拷贝/16SrRNA基因。

微生物碳底物的利用和潜在的酶活性土壤微生物C底物的利用评估与之前发表的修改。该装置由两个面对面放置的96孔微量滴度板组成。14种不同的底物，包括5种氨基酸（L-丙氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸）；4种碳水化合物（L-阿拉伯糖、D-果糖、D糖-半乳糖）、海卤糖）；四种羧酸(αketoglutaric酸、柠檬酸、L-苹果酸、草酸）；一种芳香酸；将超纯蒸馏水（对照）添加到四个重复的土壤样品中，并分配到微量滴定板上。用平板阅读器在黑暗中孵育6小时前后，在570 nm处测量指示板（Anthos 2010，Biochrom，剑桥，英国）。碳基质利用由两次测量时间之间二氧化碳浓度的差异计算得出，并以μg CO2-C g 1土壤h1表示。潜在的酶活性，包括β-葡萄糖苷酶、cellobiohydrolase，N-acetyl-β-D-glucosaminidase，亮氨酸-氨基肽酶、酸磷酸酶、酚氧化物酶和过氧化物酶，采用非荧光和光度联合测定法进行测定[54 56]。将2.0 g的新鲜土壤溶解在100 mL的100 mM醋酸钠缓冲液（pH 4.0）中。将200µLaliquots的土壤悬液置入96孔板中，然后加入相应的荧光标记底物（SigmaAldrich，CA，USA）。孵育140 min后，用FLUO星Omega（BMG Labtech，奥芬堡，德国）测量荧光强度，激发波长为365nm，发射波长为450 nm。然后根据标准曲线计算潜在的酶活性，并在nmol4-甲基白蛋白酮（MUF）或7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）g 1干法中表达土壤h1。用1 mL土壤悬液与L-3,2-4-二羟基苯丙氨酸（DOPA）（CA，CA，USA）混合为底物，测定潜在的酚氧化物酶和过氧化物酶活性。过过氧化物酶活性测定，样品接受10µL 0.3%（v/v）h2o2作为额外的底物。在孵育20小时前后，用FLUO星欧米茄（BMG Labtech，德国）在450 nm处测定吸光度。在nmol DOPA g 1干燥土壤h1中表达的吸收差异计算潜在的氧化酶活性。

对于微生物特征、营养相关基因丰度、酶活性和微生物C利用，我们计算了接受葡萄糖和未接受葡萄糖的样本之间的响应比（RR）。土壤性质和微生物特性、营养相关基因丰度、酶活性和微生物碳利用的差异，p<为0.05被认为具有统计学意义。采用重复测量方差分析检验葡萄糖添加和培养时间对累积som衍生二氧化碳的主要影响和交互作用，采用三向方差分析检验植物种类、氮添加和P添加对累积PE的影响。采用斯皮尔曼相关试验、事后试验和Mantel试验，研究了PEs与土壤性质、微生物群落RR、营养相关基因丰度、酶活性和微生物C利用之间的关系。细菌和真菌群落的RR计算为对照和葡萄糖处理之间微生物类群丰度差异的绝对值。采用主协调分析（PCoA）研究了植物种类和田间氮和磷处理对细菌和真菌群落响应的影响。采用结构序列模型（SEM）研究了土壤氮磷浓度、微生物生物量、微生物多样性、酶活性、微生物C利用和营养相关基因丰度对PE的直接和间接作用。所有的统计分析均使用R平台（版本4.2.2）和Majorbio云平台的在线工具(https://cloud.majorbio.com/page/tools/).

结果：

SOM衍生的二氧化碳和SOM启动效应

我们的结果显示，葡萄糖添加对SOM的累积二氧化碳排放有显著影响，表明豆科植物（LP）和非豆科植物（NLP）下的PE均呈阳性（图1）。此外，无论添加氮和不添加氮的磷处理均显著增加了累积启动量，而单独添加氮并不能刺激这些土壤的启动。相比之下，只有NPadad诱导nlp显著升高的启动。

图1 不同处理下som衍生的二氧化碳和启动效应。累积SOM-diruced二氧化碳通量（A、B）和启动效应（C、D）经过处理的孵化，和累积启动效应(E)的孵化（LP豆科植物，NLP非豆科植物，S物种，CK =没有氮或磷添加，N =氮添加，P =磷添加，NP=固氮和磷添加）。不同的字母表示在p<值为0.05处有显著性差异。

土壤微生物对田间和培养处理的响应

与预期的那样，在实验室培养前，植物种类和田间养分添加显著影响细菌和真菌群落组成(图。S4).孵育后，微生物群落对葡萄糖添加的响应（响应比，RR）也因优势植物和营养物质添加而存在显著差异（图2）。具体来说，主坐标分析（PCoA）显示，不同植物土壤中的细菌和真菌群落的分布形成了簇状（图2，ANOSIM <0.05）。群落相似性分析显示，不同养分处理下的细菌和真菌群落存在显著差异（图2）。此外，NLP种植园的细菌13C生物量高于LP种植园，而细菌和真菌的13C生物量显著增加（表2）。植物物种识别也显著影响了细菌和真菌生物量拓扑的RR。磷处理内细菌、真菌多样性和真菌生物量的RR存在显著差异（表2）。

图2 处理（LP=豆科植物、NLP =非豆科植物、CK =、CK =无氮、氮磷、N=氮添加、P=磷添加、NP =氮磷添加）之间细菌和真菌群落响应比（RR）的主协调分析（PCoA）。细菌和真菌群落的RR计算为葡萄糖处理和对照之间的抗菌类群的变化。

SOM启动效应的因素

土壤理化和微生物性质对慢性田间处理表现出不同的反应，其中添加磷对这些基本土壤的性质有更大的影响（表1）。PE的强度与耗氮、土壤磷浓度、细菌和真菌生物量呈显著正相关(图3a和图S7, S8).此外，微生物C利用、营养相关基因丰度和酶活性对植物特性和营养物质添加的响应也不同(表S2和图S5, S6).例如，Cchowly基因在NLP林分的NP添加和LP林分的P和NP添加中均高表达（表S2）。这些结果与我们在研究中观察到的显著PEs的情况相匹配。相应地，营养相关基因表达、酶活性和微生物循环利用率的PE与RR之间存在显著的正相关关系。（图S9).同样，在我们的研究中，一些微生物类群也表现出趋同的变异模式，导致PE和变形杆菌门、酸杆菌和放线菌门的PERRs显著相关(图S10).结构方程模型（SEM）表明，土壤N和P浓度通过改变微生物群落间接影响PE，主要是通过影响营养相关基因的比例，增加C的利用率和促进酶活性。（图S11，图4）。

图3启动效应与土壤与微生物性质的相关性关系。启动效应与微生物群落和土壤特性之间的皮尔逊相关性。B启动效应与培养后碳利用、营养循环基因表达和酶活性的响应比（RR）的相关性。通过对照与葡萄糖处理的比值计算微生物基因表达量、酶活性和微生物碳化利用的RR。在培养开始和结束时，葡萄糖处理中的TN总氮、TP总磷、AP有效磷、in无机氮及其消耗量；MBC微生物生物量碳、MBN微生物生物量氮。

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图4描述土壤启动效应背后的因素和机制的概念图。梯形的厚度随变量值的增加而增加。

讨论：

营养平衡调节了启动效应

研究结果表明，优势植物物种鉴定和长期养分添加都会影响土壤和微生物特性，从而控制土壤有机质覆盖的敏感性。葡萄糖的添加导致SOM分解增加，无论优势上层植物类型或营养添加，这一效应可归因于“微生物共代谢”，即土壤中的微生物是c饥饿的，一部分活微生物保持不活跃.不稳定的C的加入会触发微生物的激活，增强其分解SOM的能力。我们的研究结果表明，葡萄糖的添加增加了微生物的生物量、活性和SOC的利用率，导致SOM和阳性PE的二氧化碳释放增加。

大量的研究已经证明，土壤养分条件会影响SOM的分解。在我们的研究地点，长期添加磷对微生物群落和启动的影响强于添加氮。这并不令人惊讶，热带和亚热带森林往往是磷有限的，因为极端风化和高酸性土壤促进阳离子桥接和磷的吸附。因此，低磷的可用性可以限制微生物生物量和活性和磷添加对这些生态系统的影响更深远。虽然这种模式在我们的研究中普遍存在，但有趣的是，我们发现添加磷显著增加了LP土壤中的PE，而在NLP土壤中没有。这可能是由于固定氮微生物之间的关联，它们可以提供额外的氮来维持微生物活性。如结果，当LP种植园被P补充时，它们能够依靠地下的互惠者来满足对N的日益需求。然而，在NLP种植园中，这种补充可能只会导致植物N限制，这可以解释为什么P补充并不足以增加PE。结果表明，氮和磷的添加对两种林土壤的引物均不阳性。由于微生物的潜在分解能力增加，平衡和充分的营养有效性可能刺激土壤降解。平衡的营养供应导致了一个更健康的土壤微生物群落，这反过来又促进了降解SOM 的水解酶的产生。这一前提与我们对营养限制理论的理解是一致的。为了实现不稳定C输入下微生物的最佳代谢和生长，N和磷的可用性成为激活微生物代谢和生长以利用不稳定C输入获利的限制因素。这可能在热带地区尤其正确，因为土壤氮和磷的有效性可以通过它们对土壤微生物的影响，共同影响SOM的动态。通过这种方式，SOM的微生物分解和随后的PE遵循-李比希的最小定律。在这种情况下，分解是由氮和磷等必需的土壤营养水平控制的，而不是不稳定的c。这一前提与我们的观察结果一致，如正PEs，以及微生物生物量、胞外酶活性和参与营养循环的基因的异常。这说明微生物的健康和营养物质的限制是影响启动强度的重要组成部分。相应地，我们观察到，较高水平的土壤磷和氮诱导了相对较高的土壤PE，并导致SOC比不添加NP的土壤相对较低。

支持启动效应的微生物机制

土壤微生物在启动微生物效应中起着至关重要的作用，是SOM分解的主要因素。一些研究已经完成了确定土壤启动受微生物生物量和群落结构变化的影响，表明土壤养分条件的非生物影响间接影响SOM分解。同样，我们的研究发现，植物种类和长期的养分添加显著改变了微生物群落组成，而这些微生物群落组成的变化影响了土壤的启动。例如，微生物生物量的响应比与测得的PE显著相关。此外，我们发现添加人工养分的土壤群落对外源葡萄糖的反应与未施肥的不同。结果还表明，PE与变形菌门和酸杆菌丰度响应比呈正相关，与凋落物分解和SOM矿化密切相关。在其他近期研究中也发现PE和微生物类群组成之间存在显著的相关性。在我们的研究中，葡萄糖的添加增加了营养相关循环基因的丰度，而PE的强度与参与营养循环的基因丰度的RR呈正相关。这些结果表明，微生物群落在接受不稳定的C输入后，可能通过改变参与SOM分解的基因的丰度来提高其对土壤有机C的利用。微生物功能基因的高水平表达表明，微生物有机C利用和SOM分解所必需的胞外酶的高产量。一般来说，土壤有机质只有通过酶降解转化为较小的物质后才能被微生物利用。我们观察到，不稳定的C的输入促进了参与SOM矿化的酶的产生。这与我们对微生物-som分解的理解相一致，即微生物功能基因丰度的变化可以反映在特定的纤维素外酶活性上，而微生物功能基因丰度的变化之间可能存在密切的联系和酶介导的土壤C动态。例如，澳大利亚的一项大规模研究发现，微生物功能基因的丰度与c-循环相关的酶活性之间存在显著的相关性。这些发现与我们的观察结果是一致的。我们观察到，当微生物群落受到N和p等其他土壤养分的限制时，不稳定C对土壤启动具有很强的影响。在这些情况下，葡萄糖（不稳定C）的引入强烈刺激了微生物生物量、活性和与营养循环相关的基因的相对丰度。反过来，这种增强的地下活动促进了SOM分解中的正反馈，我们可以理解为启动。我们的结果表明，当与LP种植相关的自然根茎共生或人工营养添加的双营养素可利用性最少时，该PE最强。

总结

采用田间营养添加试验和人工培养试验，研究了亚热带森林中植物种类和长期氮磷添加对SOM原植物及其驱动因素的交互作用。研究发现，不稳定碳的输入通过增加土壤微生物活性和改变微生物群落组成，促进了土壤碳分解，降低了土壤碳储存潜力，特别是在土壤平衡和氮磷有效性充足的情况下。此外，在非豆科土壤中受到氮和磷的共同限制，而在豆科土壤中添加的氮仅受到磷的限制。此外，我们的研究还强调了植物种类与土壤营养适宜性之间的相互作用对影响土壤营养循环中微生物基因和酶活性丰度的影响，从而改变了土壤有机碳的微生物利用，决定了该森林生态系统中的PE。总之，本研究为我们理解微生物群落对土壤PE的功能影响提供了新的见解，并强调了植物和营养平衡之间的相互作用如何影响SOM启动。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41396-023-01523-9