本文主要是介绍7+WGCNA+机器学习+实验+泛癌分析，多要素干湿结合，希望对大家解决编程问题提供一定的参考价值，需要的开发者们随着小编来一起学习吧！
今天给同学们分享一篇生信文章“Analysis and Experimental Validation of Rheumatoid Arthritis Innate Immunity Gene CYFIP2 and Pan-Cancer”，这篇文章发表在Front Immunol期刊上，影响因子为7.3。
结果解读：
DEG筛选和数据预处理
数据在箱线图中进行了标准化，不同的颜色代表不同的数据集，行代表样本，列代表样本中的基因表达值（图1A）。图1B展示了批次去除前多个数据集的PCA结果，不同的颜色代表不同的数据集。如图所示，三个数据集分别分开，没有任何交集。图1C展示了批次去除后的PCA结果图。如图所示，三个数据集的交集可以作为后续分析的一批数据。根据P-adjustment <0.05和log2 fold-change (FC) | >0.5的标准，鉴定出了891个差异表达基因（DEGs），其中427个基因上调，464个基因下调。图1D展示了DEGs的火山图以及前50个基因的热图（图1E）。
DEGs功能富集分析
所有DEG在功能上都得到了富集，根据p<0.05，GOCircle图中显示了15个GO关键词。研究结果表明，生物过程（BP）富集主要与阳性细胞-细胞粘附调节、T细胞活化、淋巴细胞分化和细胞-细胞黏附调节有关。富集分子功能（MF）与细胞因子受体结合、细胞因子结合和细胞因子受体活性有关。细胞成分（CC）富集与质膜外侧、膜筏和膜微区有关。在KEGG分析中，造血细胞谱系、人类T细胞白血病病毒1型感染、Th1和Th2细胞分化以及趋化因子信号通路是相关的。
加权基因共表达网络构建
从GEO数据中检索到GSE1919和GSE55457数据集，并选择了15个正常样本和18个RA样本来对样本进行聚类，并通过设置阈值来排除明显异常的样本，如图2A所示。然后，如图2B所示，当R > 0.9且平均连接性较高时，作者将软阈值设置为7。通过使用0.25的聚类高度限制合并强相关的模块（图2C），共鉴定出24个模块进行进一步研究。最终，在聚类树下显示了经过调整和合并的模块（图2D）。接下来，对模块之间的相关性进行了检查，结果显示它们之间没有显著的关联（图2E）。通过模块内的转录相关性分析证明了模块划分的可靠性，结果显示模块之间没有实质性的联系（图2F）。使用ME值和临床特征之间的前额相关性来研究模块与临床症状之间的关联。蓝色模块与正常样本呈正相关（r = 0.79, p = 5e−08），与RA样本呈负相关（r = −0.79, p = 5e−0）。8)，而蓝绿色模块与正常情况呈负相关（r = 0.8，p = 3e−08），与RA呈正相关（r = −0.8，p = 3e−08）（图2G）。临床上有意义的模块被确定出来。结果显示，蓝色和蓝绿色模块在对照组MM与GS散点图（图2H）以及RA MM与GS散点图（图2I）中与RA高度相关。进一步研究了这两个模块中的所有基因。
关键模块基因的DEGs和功能分析
在使用维恩图交集关键模块基因和差异表达基因（DEG）基因后，作者发现了490个交集基因（图3A）。作者进行了功能分析，以了解模块中DEG基因的生物学功能。DO分析的结果显示这些DEG与淋巴母细胞白血病、肝炎、生殖细胞癌和造血系统疾病有关（图3B）。GO富集分析显示模块DEG基因具有T细胞激活、细胞间粘附调节、细胞激活的正调节、负向调节细胞激活、细胞外质膜、膜漂浮区、膜微区、细胞因子受体结合、抗原结合和免疫受体活性（图3C）。KEGG分析与细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路和人类免疫缺陷病毒1型感染有关（图3D）。
特征基因的选择
作者使用了三种机器算法来识别特征基因：SVM-RFE（图4A，B）；LASSO回归分析从统计学上显著的单变量中选择了19个预测基因（图4C）；以及RandomForest结合特征选择来确定错误率、分类树数量之间的关系（图4D，E），以及31个具有相对重要性的基因。作者使用Venn图找到了通过上述三种方法的交集交集的四个基因（图4F）。
特定基因表达的验证
作者使用GSE1919和GSE55447的数据确认了这四个基因在类风湿关节炎中的表达，并发现BTN3A2、CYFIP2、ST8SIA1和TYMS在类风湿关节炎中都显著升高。此外，验证数据集（GSE48780和GSE55235）表明BTN3A2、CYFIP2、ST8SIA1和TYMS在类风湿关节炎中也有显著表达。基因相关性也进行了检查，如图5所示，BTN3A2、ST8SIA1、TYMS和CYFIP2呈正相关，表明这四个基因具有显著的功能相似性。
使用GSEA分析特征基因
为了更好地理解RA中的特征基因的作用，作者使用GSEA将RA组织根据特征基因的中位数表达分为两类。核苷酸代谢、原发性免疫缺陷、嘧啶代谢和视黄醇代谢在高BTN3A2亚组中显著富集，而醛固酮调节的钠重吸收、HIF-1信号通路、氮代谢和肾细胞癌在低BTN3A2亚组中显著富集。可卡因成瘾、甘油脂质造血细胞系谱、免疫网络生产和原发性免疫缺陷在高CYFIP2亚组中显著富集，而移植排斥、肠道IgA产生的免疫网络、烟酸和烟酰胺代谢以及原发性免疫缺陷在低CYFIP2亚组中显著富集。铁死亡、亚油酸代谢、氮造血细胞系谱、肠道免疫网络对IgA产生、原发性免疫缺陷、Th1和Th2细胞分化在高ST8SIA1亚组中显著富集，而铁死亡、亚油酸代谢、氮造血细胞系谱、肠道免疫网络对IgA产生、原发性免疫缺陷、Th1和。高TYMS亚组在免疫缺陷、Th1和Th2细胞分化方面富集，而低TYMS亚组在ABC转运体、昼夜节律、糖酵解/糖异生和近曲小管碳酸氢盐回收方面显著富集。
特征基因互作分析
作者使用GeneMANIA数据库为特征基因创建了一个PPI网络（图6A）。为了进一步研究这些特征基因的功能，对20个基因进行了GO/KEGG分析。在这个数据集中，肌动蛋白聚合或解聚、Rac蛋白信号传导以及对Arp2/3复合物介导的肌动蛋白核化的控制是最丰富的生物过程。细胞前缘、薄片状突起和须状突起是最丰富的细胞组分（CC）。此外，Rho GTP酶结合、Ras GTP酶结合、小GTP酶结合和Rac GTP酶结合与富集的分子功能（MF）相关联（图6B）。根据KEGG分析，主要富集的通路包括肌动蛋白细胞骨架的调节、致病性大肠杆菌感染和沙门氏菌感染（图6C）。
RA诊断柱状线图的建模与测试
作者使用Rms软件包为特征基因（BTN3A2、CYFIP2、ST8SIA1和TYMS）构建了RA诊断柱状线图模型（图7A），并使用校准曲线评估其预测能力。校准曲线显示实际RA风险与预测风险之间的差异非常小，表明柱状线图模型RA非常准确（图7B）。ROC曲线分析也可以确认模型的正确性（图7C）。在决策曲线分析（DCA）中，“柱状线图”曲线高于灰线，而“BTN3A2、CYFIP2、ST8SIA1和TYMS”曲线意味着患者可以在0到1的高风险阈值下从柱状线图模型中获益。柱状线图模型提供了比“BTN3A2、CYFIP2、ST8SIA1和TYMS”曲线更大的临床益处（图7D）。在验证集（GSE48780和GSE55235）中进行的验证也证实了这些发现（图7E、F）。为了进一步验证BTN3A2、CYFIP2、ST8SIA1和TYMS的诊断价值，作者使用受试者工作特征（ROC）分析。BTN3A2（AUC：0.841）、CYFIP2（AUC：0.928）、ST8SIA1（AUC：0.889）和TYMS（AUC：0.发现844)具有类似的AUC值（图7G）。验证数据集（GSE48780和GSE55235）也证实了以下发现：TYMS（AUC：741），BTN3A2（AUC：0.858），CYFIP2（AUC：0.867），ST8SIA1（AUC：0.744）（图7H）。这些发现表明所有主要基因都参与了RA。
使用ssGSEA分析免疫相关性，研究类风湿关节炎组和健康对照组的免疫浸润情况
进一步使用ssGSEA研究了类风湿关节炎（RA）患者和健康对照组之间的免疫浸润关联。结果显示，在排除非统计学显著性的情况下，肥大细胞和RA中的免疫细胞浸润低于对照组，并且其余RA组中的免疫细胞浸润和免疫相关途径高于对照组（图8A）。作者知道CYFIP2与aDCs、CCR、CD8+ T细胞、检查点、细胞溶解活性、DCs、促炎、MHC I类、中性粒细胞、T细胞共抑制、T细胞共刺激、Tfh、Th1细胞、Th2细胞、TIL和I型干扰素反应相关，并且使用“corrplot”包计算特征基因之间的相关性，结果显示显著正相关（图8B）。BTN3A2与APC共刺激呈负相关。CD8+ T细胞、细胞溶解活性、iDCs、促炎、Tfh、TIL和I型干扰素反应与ST8SIA1均呈强正相关（图8B）。这些特征基因可能在RA进展过程中调节免疫过程。
CIA小鼠滑膜组织中CYFIP2和ST8SIA1的表达增加
为了验证CYFIP2和ST8SIA1在类风湿性关节炎滑膜中的表达情况，作者使用免疫组化方法处理小鼠滑膜，并发现CYFIP2和ST8SIA1CIA小鼠在滑膜中高度表达（图9）。
泛癌症CYFIP2表达
免疫基因从InnateDB数据库中提取，并交叉四个标志基因以产生两个交集基因（CYFIP2，ST8SIA1）。在合并ssGSEA结果后，作者将CYFIP2基因提升到下一个分析水平。由于免疫反应不仅在类风湿性关节炎中至关重要，而且在癌症中也很重要，作者使用交集的免疫基因来查看这两种疾病之间是否存在联系。根据TCGA数据（图10A），发现CYFIP2在BRCA、CHOL、HNSC、PRAD、THCA中高表达，在BLCA、BRCA、COAD、ESCA、GBM、KICH、KIRC、KIRP、LUAD、LUSC和PAAD中低表达。作者还从GTEx数据库下载了正常组织数据，并发现CYFIP2在BRCA、CHOL、COAD、DLBC、ESCA、HNSC、OV、PAAD、PCPG、PRAD、READ、SKCM、TGCT、THCA和THYM中强烈表达，而在BLCA、CESC、GBM、KICH、KIRC、KIRP、LGG、LIHC和LUAD中表达较弱（图10B）。正如数据所示，CYFIP2在细胞系中表达（图10C）。
CYFIP2在泛癌中的预后价值
作者研究了CYFIP2表达与全癌症患者预后之间的关系，包括总生存期（OS）、疾病特异性生存期（DSS）和无进展生存期（PFS）。在OS分析中，对33种肿瘤进行的Cox回归显示，CYFIP2表达与6种癌症的OS显著相关：KIRC、LGG、PAAD、SKCM和THYM作为保护因素，而UCEC作为风险因素（图11A）。在PFS研究中，对33种肿瘤进行的Cox回归显示，CYFIP2表达与6种恶性肿瘤的PFS显著相关，BRCA、HNSC、KIRC、LGG和PAAD为保护因素，而UCEC为风险因素（图11B）。在DSS分析中，对33种肿瘤进行的Cox回归显示，CYFIP2表达与5种癌症的DSS显著相关：BLCA、KIRC、LGG和PAAD为保护因素，而UCEC为风险因素（图11C）。
免疫浸润分析
为了更多了解CYFIP2在肿瘤免疫应答中的作用，使用TIMER数据库计算了CYFIP2表达与不同水平的免疫细胞浸润之间的关联。根据研究结果，18个肿瘤中的T细胞CD8+、20个肿瘤中的T细胞CD4+、23个肿瘤中的中性粒细胞、19个肿瘤中的髓样树突状细胞、12个肿瘤中的髓样树突状细胞以及23个恶性肿瘤中的B细胞显示出强烈的关联。HNSC、LUSC、PAAD、SKCM、STAD、THCA和THYM显示出显著的正相关，而KICH和LGG显示出显著的负相关（图12A）。使用xCELL算法（图12B）、QUANTISEQ算法（图12C）、MCPCOUNTER算法（图12D）和EPIC算法（图12E）也证明了CYFIP2水平与浸润的免疫细胞之间的关联。使用ESTIMATE算法计算了基质评分和免疫评分的估计分数，研究结果显示免疫评分与13种癌症相关，而基质评分与16种肿瘤相关。其中，免疫学评分与HNSC（R = 0.64）、LGG（R = -0.59）和STAD（R = 0.5）最为密切相关。HNSC（R = 0.42），LGG（R = −0.45），和UVM（R = 0.48）与基质评分之间有最强的相关性。CYFIP2水平和免疫检查点在多种癌症中显示高度相关，其中UVM大多数呈正相关，而BLCA、BRCA、COAD、HNSC和PRAD大多数呈负相关，这些在UVM中大多数呈负连接。
总结
为了探索免疫浸润与RA以及泛癌症之间关联的特定关键基因，作者进行了全面深入的分析，以分析相关基因和途径。作者发现的2个关键基因（CYFIP2和ST8SIA1）将拓宽我们对分子机制的理解，并为临床治疗带来更多潜在的治疗靶点，这也需要更多的研究来验证和开发。对于进一步的泛癌症分析，CYFIP2被认为是RA和33种肿瘤中最潜在的靶点，这可能为人类免疫相关疾病甚至癌症的治疗带来希望。
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