Oxford Nanopore Technologies实战应用之电信号比对工具Tombo

目录

一、前言

 二、Tombo快速使用

1.安装

2.快速使用

 3.比对结果解析

4.高阶应用

三、总结

一、前言

对于纳米孔测序常规用途，如基因组比对、SNV鉴别、宏基因组物种分析而言，用户一般使用碱基识别软件输出的fastq文件即可展开相应分析。但对于某些特殊用途，如甲基化鉴别、碱基识别算法开发，则需要深入分析纳米孔测序产生的fast5文件中原始电信号与碱基(A/T/G/C)之间的对应关系。那么，有没有软件可以实现这种功能呢？答案是ONT官方发布的软件Tombo。

 二、Tombo快速使用

1.安装

使用conda进行快速安装。

# install via bioconda environment (https://bioconda.github.io/#set-up-channels)
conda install -c bioconda ont-tombo

2.快速使用

假定fast5文件中已经有basecalls(即ATGC碱基)，且Reference序列已知，那么最快速使用Tombo进行电信号比对的命令如下。输出的比对结果会写入到fast5文件中。

tombo resquiggle path/to/fast5s/ genome.fasta --processes 4 --num-most-common-errors 5

 3.比对结果解析

首先要读入fast5文件，可以使用h5py中的h5py.File函数读入，也可以使用其他第三方fast5分析软件。

import h5py
fast5_info = h5py.File(fast5_path, 'r')

然后，就可以在fast5_info['Analyses']['RawGenomeCorrected_000']['BaseCalled_template']['Events'][:]中找到碱基与电信号的对应关系。

并且，可以通过fast5_info['Analyses']['RawGenomeCorrected_000']['BaseCalled_template']['Alignment']的attrs来查看每条fast5与参考序列的比对信息，如比对起止位点、正负链信息等。

4.高阶应用

随着ONT测序技术的更新，并非所有fast5文件都可以直接被Tombo读入，此时需要考虑2个问题：

(1)fast5中是否有basecalls？某些用户在设置测序控制软件时，产生的fast5并不一定含有basecalls，此时就需要re-basecalling。

(2)fast5可能使用了VBZ压缩，此时就需要先安装hdf5插件(参考https://github.com/nanoporetech/vbz_compression/)，然后才能继续使用h5py读取fast5。

三、总结

其实使用tombo resquiggle进行电信号比对还有许多细节需要注意，有兴趣的读者可以参考其说明书(https://nanoporetech.github.io/tombo/resquiggle.html)。比如，reads相对于reference序列出现了Indel(下图所示)要怎么获取电信号，Tombo也给出了解决方案。