三代转录组系列：使用Cogent重建基因组编码区

尽管目前已测序的物种已经很多了，但是对于一些动辄几个G的复杂基因组，还没有某个课题组有那么大的经费去测序，所以仍旧缺少高质量的完整基因组，那么这个时候一个高质量的转录组还是能够凑合用的。

二代测序的组装结果只能是差强人意，最好的结果就是不要组装，直把原模原样的转录组给你是最好的。PacBio Iso-Seq 做的就是这件事情。只不过Iso-Seq测得是转录本，由于有些基因存在可变剪切现象，所以所有将一个基因的所有转录本放在一起看，搞出一个尽量完整的编码区。

Cogent能使用高质量的全长转录组测序数据对基因组编码区进行重建，示意图如下：

Cogent流程

软件安装

虽然说软件可以直接通过conda进行安装，但是根据官方文档的流程，感觉还是很麻烦

下面操作默认你安装好了miniconda3, 且miniconda3的位置在家目录下

conda create -n cogent cogent -y
source activate cogent
conda install biopython pulp
conda install networkx==1.10
conda install -c http://conda.anaconda.org/cgat bx-python==0.7.3
pip install -i https://pypi.tuna.tsinghua.edu.cn/simple scikit-image
cd ~/miniconda3/envs/cogent
git clone https://github.com/Magdoll/Cogent.git
cd Cogent
git checkout tags/v3.3
git submodule update --init --recursive
cd  Complete-Striped-Smith-Waterman-Library/src
make
export LD_LIBRARY_PATH=$LD_LIBRARY_PATH:$HOME/miniconda3/envs/cogent/Cogent/Complete-Striped-Smith-Waterman-Library/src
export PYTHONPATH=$PYTHONPATH:$HOME/miniconda3/envs/cogent/Cogent/Complete-Striped-Smith-Waterman-Library/src
cd ../../
python setup.py build
python setup.py install

经过上面一波操作或，请用下面这行命令验证是否安装成功

run_mash.py --version
run_mash.py Cogent 3.3

此外还需要安装另外两个软件，分别是Minimap2和Mash

conda install minimap2
wget https://github.com/marbl/Mash/releases/download/v1.0.2/mash-Linux64-v1.0.2.tar.gz
tar xf mash-Linux64-v1.0.2.tar.gz
mv mash $HOME/miniconda3/envs/cogent/bin

对待大数据集，你还需要安装Cupcake

git clone https://github.com/Magdoll/cDNA_Cupcake.git
cd cDNA_Cupcake
git checkout -b tofu2 tofu2_v21
python setup.py build
python setup.py install

创建伪基因组

让我们先下载测试所用的数据集，

mkdir test
cd test
https://raw.githubusercontent.com/Magdoll/Cogent/master/test_data/test_human.fa

第一步： 从数据集中搜索同一个基因簇(gene family)的序列

这一步分为超过20,000 条序列的大数据集和低于20,000条序列这两种情况, 虽然无论那种情况，在这里我们都只用刚下载的测试数据集

小数据集

第一步：从输入中计算k-mer谱和配对距离

run_mash.py -k 30 --cpus=12 test_human.fa
# -k, k-mer大小
# --cpus， 进程数

你一定要保证你的输入是fasta格式，因为该工具目前无法自动判断输入是否是fasta格式，所以当你提供诡异的输入时，它会报错，然后继续在后台折腾。

上面这行命令做的事情是：

• 将输入的fasta文件进行拆分，你可以用--chunk_size指定每个分块的大小
• 对于每个分块计算k-mer谱
• 对于每个配对的分块，计算k-mer相似度（距离）
• 将分块合并成单个输出文件

第二步：处理距离文件，创建基因簇

process_kmer_to_graph.py  test_human.fa test_human.fa.s1000k30.dist test_human human

这里的test_human是输出文件夹，human表示输出文件名前缀。此外如果你有输入文件中每个转录亚型的丰度，那么你可以用-c参数指定该文件。

这一步会得到输出日志test_human.partition.txt，以及test_human下有每个基因family的次文件夹，文件里包含着每个基因簇的相似序列。对于不属于任何基因family的序列，会在日志文件种专门说明，这里是human.partition.txt

大数据集

如果是超过20,000点大数据集，分析就需要用到Minimap2和Cpucake了。分为如下几个步骤：

• 使用minimap2对数据进行粗分组
• 对于每个分组，使用上面提到的精细的寻找family工具
• 最后将每个分组的结果进行合并

第一步：使用minimap进行分组

run_preCluster.py要求输入文件名为isoseq_flnc.fasta, 所以需要先进行软连接

ln -s test_human.fa isoseq_flnc.fasta 
run_preCluster.py --cpus=20

为每个分组构建基因簇寻找命令

generate_batch_cmd_for_Cogent_family_finding.py --cpus=12 --cmd_filename=cmd preCluster.cluster_info.csv preCluster_out test_human

得到的是 cmd 文件，这个cmd可以直接用bash cmd运行，也可以投递到任务调度系统。

最后将结果进行合并

printf "Partition\tSize\tMembers\n" > final.partition.txt
ls preCluster_out/*/*partition.txt | xargs -n1 -i sed '1d; $d' {} | cat >> final.partition.txt

第二步：重建编码基因组

上一步得到每个基因簇, 可以分别重构编码基因组，所用的命令是reconstruct_contig.py

使用方法: reconstruct_contig.py [-h] [-k KMER_SIZE][-p OUTPUT_PREFIX] [-G GENOME_FASTA_MMI][-S SPECIES_NAME]dirname

如果你手头有一个质量不是很高的基因组，可以使用-G GENOME_FASTA_MMI和-S SPECIES_NAME提供参考基因组的信息。毕竟有一些内含子是所有转录本都缺少的，提供基因组信息，可以补充这部分缺失。

由于有多个基因簇，所以还需要批量运行命令reconstruct_contig.py

generate_batch_cmd_for_Cogent_reconstruction.py test_human > batch_recont.sh
bash batch_recont.sh

第三步: 创建伪基因组

首先获取未分配的序列， 这里用到get_seqs_from_list.py脚本来自于Cupcake, 你需要将cDNA_Cupcake/sequence添加到的环境变量PATH中。

tail -n 1 human.partition.txt | tr ',' '\n'  > unassigned.list
get_seqs_from_list.py hq_isoforms.fasta unassigned.list > unassigned.fasta

这里的测试数据集里并没有未分配的序列，所以上面这一步可省去。

然后将未分配的序列和Cogent contigs进行合并

mkdir collected
cd collected
cat ../test_human/*/cogent2.renamed.fasta ../unassigned.fasta > cogent.fake_genome.fasta

最后，将冗余的转录亚型进行合并。 这一步我们需要用Minimap2或者GMAP将Iso-seq分许得到的hq_isoforms.fasta回帖到我们的伪基因组上。 关于参数选择，请阅读Best practice for aligning Iso Seq to reference genome: minimap2, GMAP, STAR, BLAT

ln -s ../test_human.fa hq_isoforms.fasta
minimap2 -ax splice -t 30 -uf --secondary=no \cogent.fake_genome.fasta hq_isoforms.fasta > \hq_isoforms.fasta.sam

然后可以根据collapse tutorial from Cupcake将冗余的转录亚型合并

sort -k 3,3 -k 4,4n hq_isoforms.fasta.sam > hq_isoforms.fasta.sorted.sam
collapse_isoforms_by_sam.py --input hq_isoforms.fasta -s hq_isoforms.fasta.sorted.sam \-c 0.95 -i 0.85 --dun-merge-5-shorter \-o hq_isoforms.fasta.no5merge

由于这里没有每个转录亚型的丰度文件cluster_report.csv，所以下面的命令不用运行, 最终结果就是hq_isoforms.fasta.no5merge.collapsed.rep.fa

get_abundance_post_collapse.py hq_isoforms.fasta.no5merge.collapsed cluster_report.csv
filter_away_subset.py hq_isoforms.fasta.no5merge.collapsed

如果运行了上面这行代码，那么最终文件就应是hq_isoforms.fasta.no5merge.collapsed.filtered.*