EdU法细胞增殖成像分析试剂盒化验程序详细说明

细胞增殖导致许多重要的变化，包括DNA合成、细胞代谢增加和增殖特异性蛋白表达。基于荧光染色技术，BiogradetechEdU法细胞增殖成像分析试剂盒可以直接从DNA水平准确检测细胞增殖状态，同时还可以通过细胞代谢水平高通量检测细胞增殖状态。该试剂盒包含一个专利的增殖阴性对照，是一个完美的解决非标准化的增殖试验结果。目前主要包括EdU和CCK8两种常用的检测方法。  

艾美捷 Biogradetech EdU法细胞增殖成像分析试剂盒（绿色荧光）：

Cat #: D-AKK2030

Size: 100T

Storage: Stored at -20°C for 12 months, protected from light

EdU法细胞增殖成像分析试剂盒 供应材料和储存条件：

化验程序

A.用Edu标记细胞

在本实验中，以在96孔板中培养的粘附细胞为例。EdU孵育后可以涂抹悬浮细胞（在载玻片中加入适量细胞，用酒精灯烘烤至干燥）。涂抹后，染色程序与粘附细胞相同。

1.在平板中放置合适的盖玻片，播种适当数量的细胞，并在处理细胞后使其生长到所需的密度。

2.可选步骤：设置阴性对照：在EdU孵育前加入DNA合成抑制剂羟基脲，按1:1000的比例直接加入阴性对照孔中，混合孵育0.5小时。

用10mM的EdU溶液在介质中制备3.2×EdU工作溶液（20μM）。EdU的推荐最终浓度为10μM，用细胞培养基1:500稀释10mM EdU可获得2xEdU工作溶液（20μM）。

4.将相同体积的预热（37°C）的2xEdU溶液加入到含有测试细胞的培养基中，以将96孔板中EdU的最终浓度改变为1x。

注意：建议不要更换所有培养基，因为这会影响细胞增殖的速率；建议EdU的初始浓度为10μ。

5.在最合适的条件下培养细胞2小时（根据细胞扩增的时间，一般肿瘤细胞的培养时间为2小时）。

6.培养后，除去培养基，并向每个孔中加入0.1mL固定溶液（含有3.7%甲醛的PBS）。室温孵育15min。

7.取出固定剂，用0.1mL BSA工作溶液（1x）洗涤每个孔中的细胞5分钟。重复3次。

8.取出洗涤剂，向每个孔中加入0.1mL渗透剂（含有0.5%Triton X-100的PBS），并在室温下孵育15分钟。

9.去除渗透剂，并用0.1mL BSA工作溶液（1x）洗涤每个孔中的细胞5分钟。重复2次。

10.转到步骤C。

B.EdU标记活体动物

本实验以6周龄小鼠为例，其他动物EdU的标记，请参阅相关文献。

1.对于小鼠，根据10-200mg/kg的剂量，EdU可以用PBS制备成一定浓度，腹膜内注射，局部注射特定组织或器官，也可以加入饮用水中。具体剂量与所用动物的类型、重量和使用方式有关，我们可以参考相关文献，因此建议首次使用时探索EdU的浓度，或直接使用50 mg/kg的强的松浓度。如果你以前在实验中使用过BrdU，你可以将BrdU的最终浓度称为EdU的最终浓缩。EdU需要单独购买。

2.可选步骤：阴性对照的设定：在EdU处理过程中加入DNA合成抑制剂羟基脲，用浓度为1000mg/kg的EdU溶液配制。羟基脲需要单独购买。

3.24小时后或根据具体实验确定的适当时间后，迅速杀死小鼠，取出必要的组织，并按照常规步骤制作冷冻切片或石蜡切片。EdU标注的时间也可以参考相关文献进行调整。

4.对于冷冻切片：

（1） 加入适量固定溶液（含3.7%甲醛的PBS），室温孵育15分钟。

（2） 取出固定剂，用0.1mL BSA工作溶液（1x）洗涤每个孔中的细胞5分钟。重复3次。

（3） 取出洗涤剂，向每个孔中加入0.1mL渗透剂（含有0.5%Triton X-100的PBS），并在室温下孵育15分钟。

（4） 去除渗透剂，并用0.1mL BSA工作溶液（1x）洗涤每个孔中的细胞5分钟。重复2次。

（5） 抗原修复（可选）：如果同时需要对靶蛋白进行免疫荧光染色，并且需要抗原修复，可以使用合适的抗原修复液或自制的合适抗原修复液进行抗原修复。

（6） 转到步骤C。

5.对于石蜡切片：

（1） 脱蜡：在二甲苯中脱蜡5-10分钟，然后换成新鲜二甲苯，然后脱蜡5-10分钟。无水乙醇脱蜡5分钟，无水乙醇脱蜡3分钟。95%乙醇3分钟.85%乙醇3分钟75%乙醇3分钟.50%乙醇3分钟PBS 5分钟。

（2） 抗原修复（可选）：如果同时需要对靶蛋白进行免疫组织化学染色，并且需要抗原修复，可以使用合适的抗原修复液或自制合适的抗原修补液进行抗原修复。

注意：如果使用蛋白酶K或胰蛋白酶进行抗原修复，必须反复清洗，否则残留的酶会严重干扰后续的标记反应。

（3） 转到步骤C。

C.EdU检测