ChIP-seq项目文章 | Adv Sci转录因子FOXK1通过驱动小管上皮细胞糖酵解促进慢性肾脏疾病

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在慢性肾脏疾病（CKD）进展过程中，肾小管上皮细胞（TECs）经历了从脂肪酸氧化到糖酵解的能量相关代谢转变。然而，这种糖酵解爆发的机制尚不清楚。2024年7月31日，武汉大学王惠明教授团队和湖北民族大学刘伦志教授团队在Advanced Science（IF：14.6）上在线发表了题为“Forkhead Box Protein K1 Promotes Chronic Kidney Disease by Driving Glycolysis in Tubular Epithelial Cells”的文章。该文报道了一种新的关键糖酵解调节因子，即转录因子叉头盒蛋白K1（FOXK1），它在肾纤维化期间在TECs中表达，并表现出纤维化和代谢重连接能力。TECs中Foxk1位点的遗传修饰改变了糖酵解代谢和纤维化病变。爱基百客提供了ChIP-seq的技术支持。

前言

慢性肾脏疾病（CKD）已成为威胁全球公共卫生的流行病。无论其病因如何，CKD的进展最终以肾脏疾病终末期（ESRD）和与肾纤维化相关的病理改变的必然结果而告终。研究表明，TECs不仅是肾损伤的受害者，也是发生纤维化的强大驱动因素。除此之外，TECs细胞代谢的转换是肾组织纤维化病变的重要标志，也是其发生的基础。

TECs损伤期间会发生线粒体功能障碍和脂肪酸氧化（FAO）下调；此外，在CKD患者的纤维化肾脏中观察到糖酵解增强。然而，在纤维化肾脏的背景下，仍然缺乏支持TECs强劲糖酵解的直接证据。此外，考虑到FAO和糖酵解是不同的代谢途径，尽管它们是交联的，但需要阐明CKD发展过程中TECs中触发糖酵解的核心调控因子和机制。

FOXK1是FOX家族的转录因子，有报道称FOXK1通过调节糖酵解相关酶己糖激酶-II（HK2）和丙酮酸激酶M2（PKM2）介导脂肪细胞的有氧糖酵解。FOXK1是FOX家族的转录因子，具有多种功能。来自其他研究的数据表明FOX家族成员在器官纤维化中的重要作用。FOXK1是FOX家族的一员，在调控细胞自噬和细胞增殖等细胞过程中起着重要作用。值得注意的是，有报道称FOXK1通过调节糖酵解相关酶己糖激酶-II（HK2）和丙酮酸激酶M2（PKM2）介导脂肪细胞的有氧糖酵解。然而，FOXK1在CKD和TECs糖酵解中的作用在很大程度上仍未被探索。在本文中，作者利用ChIP-seq、乳酸测定、IHC等技术研究了FOXK1在TECs中启动糖酵解和肾纤维化进展中的作用。

结果展示

一、在CKD进展过程中，TECs中FOXK1表达上调

为了确定FOXK1在CKD进展中的作用，作者首先分析了小鼠单侧输尿管梗阻（UUO）和单侧缺血再灌注损伤（uni-IRI）的单细胞RNA测序数据集。TECs亚群的组成，对应于不同的细胞状况或命运。并且Foxk1表达的动态轨迹与细胞命运转变和疾病发展是一致的。此外，与肿瘤旁组织相比，梗阻性肾病肾脏中FOXK1蛋白水平显著上调。CKD患者显微解剖人体肾脏样本的免疫组化（IHC）染色显示FOXK1在CKD患者中表达上调，且表达强度随CKD分期增加，诱导的FOXK1主要分布在肾小管（肾近端小管）中。

图1 FOXK1在纤维化肾中显著上调，具有近端TEC特异性分布

二、TEC特异性Foxk1敲除小鼠肾纤维化模型

为了研究FOXK1在肾纤维化发展中的作用，作者构建了Foxk1条件等位基因敲除的小鼠（Foxk1flox/flox）与Ggt1-Cre小鼠。与Foxk1cKO小鼠相比，接受UUO治疗的Foxk1flox/flox小鼠的肾皮质更薄，外观更苍白，并且肾小管萎缩扩张和间质胶原沉积更为严重。接下来，作者检测了经典纤维化基因的蛋白水平，发现Foxk1flox/flox小鼠UUO肾中纤维连接蛋白（FN）和α-平滑肌肌动蛋白（𝛼-SMA）上调，而Foxk1cKO小鼠的这种诱导程度大大降低。肾组织中指示的蛋白质水平变化与mRNA水平一致。在基于UUO疾病模型的研究基础上，在另一种进行性CKD小鼠模型IRI小鼠中得到了类似的结果，证实了FOXK1在小鼠肾纤维化发展中的致病作用。

图2 小管特异性FOXK1缺失改善UUO模型肾纤维化

三、FOXK1敲除减弱TGF-𝜷1诱导培养小管细胞的促纤维化作用

为了研究糖酵解与FOXK1之间的关联，作者用TGF-𝛽1（糖酵解调节因子）处理了小鼠近端小管细胞（BUMPT细胞）和人源细胞（HK-2细胞）。免疫荧光染色显示，TGF-𝛽1诱导FOXK1主要存在于HK-2细胞的细胞核内。在TGF-𝛽1刺激下，FOXK1和纤维化标志物FN、𝛼-SMA在蛋白或mRNA上均显著上调。在转染shRNA敲低FOXK1的小管细胞中，与转染对照shRNA的细胞相比，FN和𝛼-SMA在TGF-𝛽1刺激下的上调被显著抑制。这些体外实验结果表明，纤维化因子TGF-𝛽1诱导FOXK1表达和核易位，有利于TECs的促纤维化作用。

图3 TGF-𝛽1刺激下FOXK1对TECs有促纤维化作用

四、TGF-𝜷1治疗增加全基因组FOXK1的占用

FOXK1是一种参与糖代谢、细胞增殖和自噬的转录因子，其功能主要通过对靶基因的转录调控来实现。为了探索FOXK1在肾纤维化中的转录调控机制，作者使用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析了FOXK1在HK-2细胞中的全基因组分布。作者发现TGF-𝛽1处理显著提高了FOXK1在染色质上的占用率，24小时的TGF-𝛽1刺激也增加了基因区域的FOXK1信号强度。

motif分析发现，在TGF-𝛽1处理或未经处理的HK-2细胞中，FOXK1占据区域附近有几个转录因子结合位点，包括FOXK2、AP1、RUNX和NF-𝜅B。富集分析显示FOXK1结合基因与代谢过程、糖酵解/糖异生途径相关。糖酵解相关基因SLC2A2、HK1、FBP1、ALDOA、BPGM、LDHC的可视化也表明了TGF-𝛽1刺激引起FOXK1结合增加,并通过ChIP-qPCR进一步进行了证实。这些结果确定了TGF-𝛽1刺激下TECs中FOXK1能够调控糖酵解相关的靶基因。

图4 FOXK1调控糖酵解基因的转录

五、FOXK1促进TECs糖酵解并影响线粒体功能

随后，作者评估了FOXK1在调节培养TEC糖酵解中的作用。差异表达基因（DEG）热图显示，糖酵解相关基因受到FOXK1修饰和TGF-𝛽1处理的干扰。在TGF-𝛽1存在的情况下，BUMPT细胞和HK-2细胞的培养基呈现明显的酸性和较高的乳酸浓度。FOXK1的下调显著下调了糖酵解相关分子的蛋白水平，并导致HK-2细胞乳酸生成减少。此外，FOXK1缺乏导致接受UUO或IRI手术的FOXK1cKO小鼠的离体肾小管中乳酸生成、糖酵解相关基因mRNA水平和蛋白质水平的显著降低。

此外，作者测量了TGF-𝛽1刺激后HK-2细胞的细胞外酸化率（ECAR）和耗氧率（OCR）。TGF-𝛽1刺激可提高HK-2细胞的ECAR，降低OCR，当FOXK1被沉默时，这些作用显著减弱，当FOXK1重新表达时，这些作用增强。综上所述，这些结果表明，在患病条件下，FOXK1在TEC中向糖酵解的能量转移中起着关键作用。

图5 FOXK1通过糖酵解相关基因的转录调控触发糖酵解

六、FOXK1依赖于液-液相分离（LLPS）发挥转录活性

细胞内生物大分子，如蛋白质和核酸，通过LLPS的物理化学机制自组装成液体状凝聚物，它提供了基本上无膜的隔间、浓缩和分离的细胞成分，以实现一系列独特的生理功能，包括活细胞中的转录活动。通过序列分析和预测，作者发现FOXK1蛋白含有4个内在无序区（intrinsic disordered regions, IDRs），这些区域对于形成液体凝析物至关重要，表明FOXK1具有形成凝析物的性质。

随后作者构建并纯化了重组FOXK1-mEGFP融合蛋白。1,6-己二醇（1,6-HD）是一种脂肪醇，被广泛用于溶解LLPS液滴。将FOXK1-mEGFP加入到含有10%聚乙二醇-分子量8000（PEG-8000）缓冲液中，发现溶液变得不透明，而加入1,6-HD后溶液恢复清晰。液滴形成实验显示，FOXK1-mEGFP以浓度依赖的方式形成相分离的球形液滴，而mEGFP在所有测试条件下都保持弥散。FOXK1-mEGFP的液滴数量和液滴总面积与NaCl或3%1,6-己二醇浓度呈负相关。

为了确定单个FOXK1 IDR对相分离的贡献，作者使用mEGFP-tagged质粒生成了三种肽:含有第一个IDR的肽（FOXK11-133），含有第二个IDR的肽（FOXK1210-303），以及含有第三和第四个IDR的肽（FOXK1415-733）。液滴形成实验显示FOXK1210-303-mEGFP在HK-2细胞核中显示出更大、更多的液滴，并在1,6己二醇处理和NaCl处理下，液滴的大小和数量都有所减少。这些结果表明FOXK1液滴具有高动态，FOXK1可以在细胞核内形成凝析物；其中FOXK1210-303形成液滴的能力相对更好。

图6 FOXK1蛋白具有形成液滴的能力

七、FOXK1凝聚物包含活性基因转录必需的转录蛋白

先前的研究发现，相分离参与了RNA聚合酶II（RNA Pol II）在启动子区域的转录延伸活性。为了确定FOXK1凝聚物是否参与RNA Pol II转录调控复合物的组装，作者首先评估了RNA Pol II与FOXK1 IDR的共定位。发现FOXK1210-303-mEGFP与RNA Pol II共定位后形成大凝聚体。随后作者使用Integrated Interactions Database进一步分析了RNA Pol II与FOXK1相互作用的亚基，发现FOXK1与RNA Pol II亚基之一POLR2K（RNA Pol II亚基K）相互作用。并使用共免疫沉淀实验进行了验证。研究结果表明IDR对驱动FOXK1转录功能至关重要。

图7 FOXK1 IDRs与活细胞内液滴中的RNA PoI II相互作用

八、肾包膜下（SC）给药AAV9-shFoxk1可显著减轻UUO和IRI小鼠模型的肾纤维化病变

TECs特异性的Foxk1缺失抑制了肾纤维化的发展，这启发了靶向Foxk1治疗CKD的治疗潜力。因此，作者探索了一种以腺相关病毒（AAV）血清型9（AAV9）作为基因传递工具，通过肾SC给药的基因治疗策略。作者构建了Ksp-cadherin启动子方向携带Foxk1特异性shRNA的AAV9（AAV9-shFoxk1）以及AAV9-shctrl，并通过肾SC注射给6周龄小鼠。注射AAV9-shFoxk1 6周后，肾脏中FOXK1 mRNA和蛋白表达均显著降低。在UUO和IRI小鼠模型中，AAV9-shFoxk1处理的小鼠肾脏纤维化明显减轻，糖酵解强度和糖酵解相关转录物显著下调。这些结果表明，在CKD治疗中有希望通过FOXK1靶向基因治疗来预防病变肾脏的糖酵解和纤维化病变。

文章总结

总之，本文在肾纤维化进程中发现了一个新的纤维化因子，转录因子FOXK1，它以近端TEC特异性分布和损伤和修复失败的细胞状态相关的方式出现。FOXK1在TECs中促进从FAO到糖酵解的能量代谢转换和加重肾纤维化进程中起关键作用。FOXK1转录上调了一系列糖酵解相关基因，这些基因通过细胞核内的LLPS形成凝聚体，并与靶基因基序相互作用。此外，还探索了以腺相关病毒血清型9（AAV9）作为基因传递工具，通过肾SC给药的肾纤维化基因治疗策略。

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