脲酶丨Worthington杰克豆脲酶的特性及测定方案

脲酶催化尿素水解：

（NH2）2CO+3H2O→CO2+2NH4OH

Jespersen (1975) 报道氨基甲酸铵是在柠檬酸盐和 Tris 缓冲液中产生的。

脲酶存在于许多细菌、几种酵母和许多高等植物中。Varner (1960) 对其进行了审查。两个最好的来源是：杰克豆（Canavlia ensiformis），它已经被结晶和彻底研究，以及巴氏杆菌。

该酶在尿素测定中很重要。参见 Guilbault 和 Montalvo (1970)。已报道其固定化：等。(1974)、James 和 Pring (1975)、Messing (1974)、Nakamoto等人。(1975)、Sundaram (1973) 和 Tran-Minh 和 Broun (1975)。

艾美捷Worthington杰克豆脲酶的特性：

分子量：480,000 (Fishbein et al . 1970)。

组成： 单体（a）脲酶可以聚合形成约三百万道尔顿的六个单元聚合物。（Fishbein等人1970；Fishbein 和 Nagarajan 1972a）。Andrews 和 Reithel (1970) 报告了巯基。Contaxis 和 Reithel (1971) 表明分子可以分成两半而不会失去活性。另见 Contaxis 和 Reithel (1972)、Fishbein 和 Nagarajan (1972b)、Lynn (1970) 以及 Bailey 和 Boulter (1969)。

最佳 pH 值：7.4（Cesareo 和 Langton，1992）。

Km：Tris·HCl 中 1.3mM（Cesareo 和 Langton，1992）。

抑制剂：重金属。形成NH 4+离子。另见 Fishbein 和 Carbone (1965)。钠和钾离子是抑制剂（Cesareo 和 Langton，1992）。

特异性：脲酶对尿素和羟基脲具有特异性（Fishbein 和 Carbone 1965）。另见 Sundaram 和 Laidler (1970)。

稳定剂：浓度为 1 X 10 -3 M 的 EDTA。50% 甘油溶液可在 4°C 下保护脲酶结晶悬浮液数月。

艾美捷Worthington脲酶测定方法：

方法：Worthington 采用了一种测定方法，其中通过将氨生成与谷氨酸脱氢酶反应偶联来测量尿素的水解。

在指定条件下，在 25°C 和 pH 7.6 条件下，一个单位会导致每分钟氧化 1 微摩尔 NADH。除了提高灵敏度外，该测定方法还具有可以对其进行操作以允许对尿素进行定量的优点。

试剂：

0.1 M 磷酸钾缓冲液，pH 7.6

磷酸盐缓冲液中的 0.023 M Adenosine-5'-diphosphate (ADP)

磷酸盐缓冲液中的 0.0072 M NADH

磷酸盐缓冲液中的 0.026 M a-酮戊二酸

磷酸盐缓冲液中的 1.8 M 尿素

谷氨酸脱氢酶：在 50% 甘油或磷酸盐缓冲液中稀释至约 500 单位/ml。使用期间冷藏。

酶：

将酶以 1 mg/ml 溶解在 0.1 M 磷酸盐缓冲液中，pH 7.6。临用前，在缓冲液中进一步稀释以获得 0.02-0.04 ΔA/分钟的速率。

程序：

将分光光度计调整到 340 nm 和 25°C。将移液器移入每个比色皿，如下所示：

0.10 M 磷酸盐缓冲液，pH 7.6 2.4 毫升

0.023 M ADP 0.1 毫升

0.0072 M NADH 0.1 毫升

0.026 M α-酮戊二酸 0.1 毫升

1.8 M 尿素 0.1 毫升

GLDH (500 单位/毫升) 0.1 毫升

在分光光度计中于 25°C 孵育 5-10 分钟以达到温度平衡并确定空白率（如果有）。由于试剂中的微量氨，可能会观察到吸光度的轻微变化。在吸光度变化为零后，加入 0.1 ml 适当稀释的酶。记录 A 340减少8-10 分钟。从曲线的线性部分确定 ΔA 340 /分钟。可能会出现轻微的延迟。