本文主要是介绍脲酶丨Worthington杰克豆脲酶的特性及测定方案,希望对大家解决编程问题提供一定的参考价值,需要的开发者们随着小编来一起学习吧!
脲酶催化尿素水解:
(NH2)2CO+3H2O→CO2+2NH4OH
Jespersen (1975) 报道氨基甲酸铵是在柠檬酸盐和 Tris 缓冲液中产生的。
脲酶存在于许多细菌、几种酵母和许多高等植物中。Varner (1960) 对其进行了审查。两个最好的来源是:杰克豆(Canavlia ensiformis),它已经被结晶和彻底研究,以及巴氏杆菌。
该酶在尿素测定中很重要。参见 Guilbault 和 Montalvo (1970)。已报道其固定化:等。(1974)、James 和 Pring (1975)、Messing (1974)、Nakamoto等人。(1975)、Sundaram (1973) 和 Tran-Minh 和 Broun (1975)。
艾美捷Worthington杰克豆脲酶的特性:
分子量:480,000 (Fishbein et al . 1970)。
组成: 单体(a)脲酶可以聚合形成约三百万道尔顿的六个单元聚合物。(Fishbein等人1970;Fishbein 和 Nagarajan 1972a)。Andrews 和 Reithel (1970) 报告了巯基。Contaxis 和 Reithel (1971) 表明分子可以分成两半而不会失去活性。另见 Contaxis 和 Reithel (1972)、Fishbein 和 Nagarajan (1972b)、Lynn (1970) 以及 Bailey 和 Boulter (1969)。
最佳 pH 值:7.4(Cesareo 和 Langton,1992)。
Km:Tris·HCl 中 1.3mM(Cesareo 和 Langton,1992)。
抑制剂:重金属。形成NH 4+离子。另见 Fishbein 和 Carbone (1965)。钠和钾离子是抑制剂(Cesareo 和 Langton,1992)。
特异性:脲酶对尿素和羟基脲具有特异性(Fishbein 和 Carbone 1965)。另见 Sundaram 和 Laidler (1970)。
稳定剂:浓度为 1 X 10 -3 M 的 EDTA。50% 甘油溶液可在 4°C 下保护脲酶结晶悬浮液数月。
艾美捷Worthington脲酶测定方法:
方法:Worthington 采用了一种测定方法,其中通过将氨生成与谷氨酸脱氢酶反应偶联来测量尿素的水解。
在指定条件下,在 25°C 和 pH 7.6 条件下,一个单位会导致每分钟氧化 1 微摩尔 NADH。除了提高灵敏度外,该测定方法还具有可以对其进行操作以允许对尿素进行定量的优点。
试剂:
0.1 M 磷酸钾缓冲液,pH 7.6
磷酸盐缓冲液中的 0.023 M Adenosine-5'-diphosphate (ADP)
磷酸盐缓冲液中的 0.0072 M NADH
磷酸盐缓冲液中的 0.026 M a-酮戊二酸
磷酸盐缓冲液中的 1.8 M 尿素
谷氨酸脱氢酶:在 50% 甘油或磷酸盐缓冲液中稀释至约 500 单位/ml。使用期间冷藏。
酶:
将酶以 1 mg/ml 溶解在 0.1 M 磷酸盐缓冲液中,pH 7.6。临用前,在缓冲液中进一步稀释以获得 0.02-0.04 ΔA/分钟的速率。
程序:
将分光光度计调整到 340 nm 和 25°C。将移液器移入每个比色皿,如下所示:
0.10 M 磷酸盐缓冲液,pH 7.6 2.4 毫升
0.023 M ADP 0.1 毫升
0.0072 M NADH 0.1 毫升
0.026 M α-酮戊二酸 0.1 毫升
1.8 M 尿素 0.1 毫升
GLDH (500 单位/毫升) 0.1 毫升
在分光光度计中于 25°C 孵育 5-10 分钟以达到温度平衡并确定空白率(如果有)。由于试剂中的微量氨,可能会观察到吸光度的轻微变化。在吸光度变化为零后,加入 0.1 ml 适当稀释的酶。记录 A 340减少8-10 分钟。从曲线的线性部分确定 ΔA 340 /分钟。可能会出现轻微的延迟。
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