iMeta | tNGS利器：跨物种超多重靶向测序引物设计软件MultiPrime

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MultiPrime：一款可靠、高效的靶向测序工具

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方法论文

● 原文链接DOI: https://doi.org/10.1002/imt2.143

● 2023年10月19日，西安交通大学联合予果生物科技（北京）有限公司、中国农业科学院深圳农业基因组研究所和香港科技大学在 iMeta 在线发表了题为 “MultiPrime: A Reliable and Efficient Tool for Targeted Next-Generation Sequencing” 的文章。

● 本研究使用包含8种病毒的43,016条序列的数据集来评估multiPrime的性能，结果表明MultiPrime是一款强大且实用的工具，可以应对针对不同微生物群落或基因的靶向测序挑战。

● 第一作者：夏涵、张哲、骆晨、魏康飞

● 通讯作者：官远林、林铨振、杨军波（1806389316@pku.edu.cn）

● 合作作者：李绪明、穆西玉、段美林、朱传龙等

● 主要单位：西安交通大学、予果生物（北京）科技有限公司、中国农业科学院深圳农业基因组研究所、香港科技大学

亮   点

●  MultiPrime是一款用户友好的引物设计工具，可以从输入序列一步到位获得适用于多重tNGS技术的引物池；

●  MultiPrime的简并引物设计允许一定量的错配存在，提高了在检测广谱序列方面的灵敏度和特异性；

●  MultiPrime在运行时间、单对引物覆盖范围和最终引物池中引物数量方面优于其他工具；

●  MultiPrime应用范围广泛，可以用于检测单个或多个基因、外显子、反义链、RNA或其他特定的DNA片段。

摘  要

MultiPrime是一款自动化设计最小引物池的新工具，适用于对特定的微生物群落或基因进行针对性的靶向测序。MultiPrime通过容忍错配设计简并引物，提高引物覆盖率的同时确保高度的兼容性和特异性。我们使用包含8种病毒的43,016条序列的数据集来评估multiPrime的性能。研究结果表明，multiPrime在多个方面的性能上都优于传统工具，包括运行时间、单个引物覆盖范围和最终引物池中引物数量等，此外，由multiPrime设计的引物池可以成功地扩增出目标片段。我们还将multiPrime的应用扩展到了30种病毒，并在80个临床样本中验证了其设计的引物池的有效性。针对这些引物扩增产物的测序结果显示出94%的灵敏度和89%的特异性，这些结果证明了MultiPrime是一款强大且实用的工具，可以应对针对不同微生物群落或基因的靶向测序挑战。

视频解读

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Youtube：https://youtu.be/obbTf7Yd18s

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全文解读

引  言

靶向测序（tNGS）由于其高效、经济和广泛的应用范围，已成为微生物组研究领域中重要手段之一。宏基因组测序（mNGS）和宏转录组测序技术可以用来全面地分析微生物组，但由于人类和环境微生物基因组的污染，这些技术需要大量的样本量和测序数据，导致费用高昂、分析耗时，且解读结果困难。虽然可以在 DNA 提取过程中减少人类基因组污染，但在资源有限和紧急情况下，这种方法的实施具有局限性，这与基于杂交的芯片捕获测序类似。相较于这些技术，基于聚合酶链反应（PCR）的靶向测序（tNGS）可以同时富集多个目标序列，是一种简便且经济的方法。tNGS能够迅速扩增已知微生物基因组的目标片段，包括毒力或耐药基因，从而在几小时内获得结果。目前，广泛应用于系统分类的扩增 rRNA 基因序列的引物已在微生物群落组成分析中发挥关键作用，然而，对于一些微生物组（如病毒组），由于其缺乏保守区域和高度的遗传多样性，引物设计面临独特的挑战，需要创新的方法进行应对。

tNGS成功的关键在于引物设计，而引物的熔解温度、GC含量和二级结构等因素对其有效的靶向扩增至关重要。尽管已经开发了许多辅助引物设计的软件，但很少有专门针对tNGS需求的工具。现有的方法大体上可以分为三类：第一，传统的PCR引物设计工具，适用于小规模的目标序列集合；第二，基于序列比对或K-mer生成简并引物的工具，需要在覆盖范围和简并度之间取得微妙的平衡；第三，机器学习算法和其他算法工具，在处理简并碱基和复杂的目标序列时通常会遇到限制。由于目前工具的局限性，为大规模和多样化的目标序列设计引物仍然存在很大的挑战。

我们开发了multiPrime，这是一款专为多靶标的多重PCR设计的新型引物设计工具。其主要创新点在于引入“错配容忍”的方法进行引物设计优化。multiPrime的核心思想是利用互补碱基Watson-Crick杂交过程可以容忍轻微的碱基错配。尽管存在这些错配，但准确配对碱基的热力学稳定性通常优于未配对的碱基，这会导致引物-模板的错配退火，虽然可能会影响PCR效率，但并不会完全阻碍扩增过程。大量的实验研究证明了错配扩增的可行性，与完全互补匹配的引物-模板退火相比，少量错配碱基依然可以获得相媲美的结果，例如已广泛应用的扩增阻滞突变系统PCR（ARMS-PCR）。multiPrime旨在取得引物的特异性和效率之间微妙的平衡，通过将容忍的错配巧妙地融入引物设计策略，增强了引物池的覆盖范围和效率，为应对广泛和多样化目标序列所带来的引物设计复杂性提供了有效的解决途径。本研究中，我们用病毒基因组构建具有复杂遗传多样性的多核酸序列集来开发multiPrime。MultiPrime不仅在病毒组的研究中具有潜力，还可以用于针对不同核苷酸序列的靶向测序（tNGS），增强tNGS技术的性能，为经济、高效地检测多样化微生物组和深入了解这些多样化微生态系统的复杂性提供了简便和较全面的解决方案。

结  果

MultiPrime显著减小了引物池的规模，同时提高了覆盖范围和兼容性

MultiPrime设计的引物允许存在X（0、1或2）个错配，因此降低了碱基简并度并提高了覆盖率。例如，为了覆盖所有10条输入序列（图1A），需要一条高依赖值为512的引物（图1B）。而通过在引物设计中引入单个错配，我们可以找到4个潜在的引物，在覆盖所有10个目标序列的同时，其简并度显著降至4。

图1. 具有完美匹配和允许1个错配的简并引物对10条输入序列的捕获率

输入序列（A）和简并引物（B），允许1个错配的简并引物与不允许错配的简并引物相比明显减少了引物的简并度。

为了研究容忍错配对提高引物覆盖率的潜力，我们用1000条人类轮状病毒A的核酸序列分别在允许0、1和2个错配的情况下设计了简并引物（图2A）。计算机模拟结果显示，具有1或2个错配的引物显著提高了引物的覆盖范围，表明了使用容忍错配的引物可以达到更高的覆盖度。针对设计简并引物的性能，我们将multiPrime的引物设计模块与DegePrime进行了比较，DegePrime是一款广泛使用的设计简并引物的工具，其性能已被证明超越HYDEN等其他工具。对比结果表明，通过容忍1个错配的方式设计的multiPrime引物在覆盖率上明显优于DegePrime设计的引物（图2B），特别是当引物区域的熵小于3时（图2C），这一优势在设计成对引物时更加明显（图2D）。结果显示，无论是一个引物对（98.7%）还是追求全覆盖时（100%）的最小引物对数，multiPrime的引物设计模块大都更有优势。此外，我们尝试使用DegePrime对未覆盖的序列进行迭代引物设计，但由于引物兼容性的问题迭代在第4轮时停止，无法设计出额外的引物以增加覆盖率（图2E）。

虽然使用multiPrime减少引物池中的引物数量可以显著降低引物间不兼容性的风险，但引物二聚体的形成仍然是一个主要挑战。针对这个挑战，我们采用经验损失函数来评估引物池中潜在的二聚体情况，并使用multiPrime设计的基于213-plex PCR系统的5批、共计154个扩增产物的二代文库来优化损失函数的阈值。结果显示，二聚体的比例从57.23 ± 23.5%（n = 117）显著降低到4.97 ± 2.07%（n = 37）（图2F、G）。

MultiPrime在大规模和多样化序列的引物池优化方面优于传统方法

我们尝试使用多种软件为来自8种不同病毒的43,016条序列设计最小引物池，但都以失败告终。为解除这一限制，我们通过将multiPrime的引物设计模块替换为DegePrime，然后对修改后的multiPrime和原始版本进行性能比较分析。其中，每种病毒的同一性分析显示了输入序列的高度多样性（图2H），分析结果表明了multiPrime的引物设计模块在引物设计效率方面优于DegePrime。在运行耗时方面也表现突出，multiPrime的引物设计模块仅需17分钟完成设计引物，而DegePrime则需要48分钟。由multiPrime设计的引物池在不同参数下达到了大于96%和95%的覆盖率，明显高于DegePrime的覆盖率（分别为78%和69%）（图2I）。对于每种病毒的覆盖率，multiPrime设计的引物池也显著高于DegePrime设计的引物池（图2J）。此外， Primux也被用来进行比较，它是一款依赖于K-mer设计的工具，然而，在其运行约70小时后出现分段错误导致的程序崩溃。以上结果表明，multiPrime在处理大规模和多样化序列时非常有效，而传统的引物设计软件，如DegePrime或Primux，无法达到相同的效果。

图 2. MultiPrime能够高效扩展覆盖范围并提高兼容性

（A）使用1000条序列在允许0、1和2个错配时设计的引物的覆盖范围。

（B）由multiPrime和DegePrime设计的单个引物覆盖的累积分数。

（C）由multiPrime和DegePrime设计的单个引物在不同熵值区域的覆盖范围。

（D）DegePrime和multiPrime的前100个引物对的覆盖范围。

（E）DegePrime和multiPrime达到不同覆盖率分别所需的引物对数量。

（F）热图和（G）箱线图来显示二聚体百分比。通过引入损失函数筛选显著减少了最终测序时产生的二聚体比例。二聚体检查之前（DZ之前）为不进行损失函数检查的最终引物池，二聚体检查之后（DZ之后）为进行损失函数检查后的最终引物池。

（H）八种病毒的种内序列同源性分布。

（I）核心引物池对于8种病毒序列的覆盖度的评估情况。引物池分别是由multiPrime（v2.0.2）和DegePrime设计的，multiPrime具体参数如下：同一性：0.8；seq_number_ANI：60；drop：“T”；坐标：0；其他：默认。有关参数的详细定义，请参阅GitHub上的YAML文件。

（J）引物池对于每种病毒的累积覆盖范围，其中 HPIV代表人类副流感病毒；HRSV代表人类呼吸道合胞病毒。

使用长读长和短读长测序平台分别对multiPrime设计的引物池进行实验验证

为了验证目标序列能否被设计的引物顺利扩增，引物池被用于30个临床样本和3个阴性对照样本中扩增PCR产物，然后通过长读长测序平台（ONT）对扩增产物进行测序。分析结果表明所有病毒都能够准确地通过目标片段进行鉴定，同时阴性对照样本中未检测到任何病毒序列，说明了引物池的高特异性（图3A）。此外，临床样本中可以检测到两种目标病毒，证明了引物池检测复杂感染的能力，这对于临床准确诊断和治疗至关重要。

为了进一步验证multiPrime设计的引物池的准确性和有效性，我们将靶标扩大至30种病毒，在避免3'端的错配的前提下设计了一个更大的引物池，并用80个临床样本对其进行性能验证。分析结果表明，该引物池能够利用基于二代测序平台单端75bp测序的序列来进行病毒检测（图3B），且具有87%的敏感性、94%的特异性和89%的准确性。这些结果证明了由multiPrime设计的引物池可以用来进行可靠且精确的病毒检测。

图 3.使用两个测序平台分别验证由multiPrime设计的两个引物池

(A) 在ONT平台上验证引物池。MCS代表混合的临床标本（1管内含2-4个临床标本），NC代表阴性对照，星号表示目标病毒。

(B) 在NextSeq 500平台上验证引物池。引物池由multiPrime（v2.0.3）设计，使用以下参数：坐标：4；seq_number_ANI：10；其他：默认。Clinical NC指的是从健康个体获取的不含任何病毒序列的样本，NC指的是故意留空、没有任何模板的阴性对照样本，星号表示目标病毒。

multiPrime在其他场景中的应用

为了评估引物池在物种捕获多样性和丰度方面的效能，我们设计了针对16种流行病原体的引物池，并将其在3个样本中的扩增结果与相对应的mNGS结果进行了对比。结果显示引物池在目标检测方面与mNGS相媲美。值得注意的是，所有靶标都鉴别成功，并且其相应的Reads计数明显超过mNGS法获得的计数（图4A-C）。这些结果表明了multiPrime设计的引物池在捕获目标序列的多样性和丰度方面的有效性。

图4. 引物池捕获多样性序列的有效性

对于3个临床样本，即临床样本1（A）、临床样本2（B）和临床样本3（C），分别对比其在mNGS和tNGS中获得了目标读数（条形图，左）和百分比（雷达图，右）。这些样本共包含16种病原体，包括真菌，细菌和病毒等。

方  法

multiPrime的工作流程如图5所示，生物信息学流程如图6所示。multiPrime中的所有脚本都是用Python编写的，联合流程使用Snakemake 编写。multiPrime的输入是一个FASTA格式文件，可以是一组CDS、基因、基因组或其他类型的序列。multiPrime有三个主要步骤：首先，multiPrime按同一性对序列进行分类；其次，multiPrime从每个类别随机选择N（默认值：500）条序列，生成多重比对结果，并通过允许错配的方式设计简并引物。最后，根据二聚体检测和特异性评估，使用贪心算法将分类间引物对组合成一个引物池。

图5. multiPrime一步式tNGS引物池设计方法示意图

1，输入：在这个初始阶段，需要收集目标序列的集合。

2，分类：消除冗余序列，并基于序列相似性建立聚类。

3，为每个聚类设计简并引物：使用MUSCLE或MAFFT进行多序列比对，然后利用最近邻模型设计候选引物。

4，聚类间引物对组合：选择引物对时考虑多种因素，包括PCR产物长度、熔解温度、二聚体形成评估、容错覆盖等相关标准。随后，通过贪婪算法，根据二聚体形成分析将引物对合并为最佳的极小引物池。

图6. multiPrime一步式tNGS引物池设计方法流程图

讨  论

tNGS的有效性和检测能力在很大程度上依赖于所使用的引物池，因此提高引物覆盖率成为一个主要关注点。传统的tNGS引物池候选（PSC）的方法是“分而治之”的程序。此方法将输入序列分成两组，一组引物可以捕获，另一组不能捕获，并对不能捕获的序列重复该过程，直到所有序列都匹配或找不到候选引物为止。由于必须确保新设计的引物不与现有引物发生相互作用，以防止非特异性扩增和减少二聚体形成，因此在每次迭代中设计引物并评估其兼容性是一项充满挑战且耗时的任务。为了解决这些挑战，一个有效的方法是首先根据相似性对输入序列进行分组，为每组设计引物，然后将组间引物合并成一个引物池。然而，该策略的成功取决于每个组的引物覆盖率是否足够高。如果引物覆盖率不足则无法进行。

MultiPrime的目标是设计一种容忍X个错配的简并引物，它尽可能的与所有输入序列相似，以便可以良好匹配。与传统的引物设计工具相比，multiPrime可以产生更多具有更高覆盖率的候选引物，从而形成了一个引物数量更少、扩增更有效的引物池。此外，multiPrime使用损失函数来评估二聚体形成的可能性，降低引物池内二聚体形成的概率，增加扩展引物池的灵活性。总之，MultiPrime为tNGS的一步式引物池设计提供了一种创新且高效的方法。

PCR失败可能归因于各种因素，如污染、模板质量差、操作员熟练度不足或PCR条件不佳等。因此，必须验证引物池中的所有引物对，并监测它们的扩增效率以确保混池扩增的准确性。而更改特定引物对的试剂或反应系统可能会影响其他引物的扩增，因此需要额外验证引物对。MultiPrime提供了一系列适用于各序列分类内的候选引物对，可以补充或替代引物池中的现有引物对，使研究人员能够设计更有效的引物集合以满足其研发需求。

代码和数据可用性

用户可以在https://github.com/joybio/multiPrime上免费获取multiPrime的使用手册和软件。multiPrime的安装视频可以在Figshare（https://figshare.com/articles/media/Installation_video_of_multiPrime/23904159）上找到。

引文格式：

Han Xia, Zhe Zhang, Chen Luo, Kangfei Wei, Xuming Li, Xiyu Mu, Meilin Duan, Chuanlong Zhu, Luyi Jin, Xiaoqing He, Lingjie Tang, Long Hu, Yuanlin Guan, David C. C. Lam, Junbo Yang. 2023. “MultiPrime: A reliable and efficient tool for targeted next-generation sequencing”. iMeta e143. https://doi.org/10.1002/imt2.143

作者简介

夏涵（第一作者）

●  近10年跨国药企工作经验，2017年创立予果生物，主导公司学术研究和技术研发。

●  主要研究领域与方向：感染与免疫、微生态、宏基因组微生物检测、临床宏基因组病原检测的应用。参与十三五、十四五国家重点项目和多项省级重点项目，发表论文5篇，拥有自主知识产权专利百余项，其中发明20项，软著80项。中国医药生物技术协会生物诊断技术分会第三届委员常务委员，医用高通量测序标准化技术归口单位专家，广东省医疗行业协会中枢神经系统感染管理分会第一届委员会副主任委员，中国医学装备协会基因检测分会第一届委员，省级人才和地方领军人物、HICOOL全球创业大赛一等奖。

张哲（第一作者）

●  香港科技大学博士生。

●  目前主要专注于可穿戴生物医疗器械，智能柔性皮肤以及生物信息大数据等方向。

骆晨（第一作者）

● 中科院生物物理所博士，中国农业科学院博士后，北京百迈客生物科技有限公司博士后。

● 目前研究主要课题为病原微生物检测。

魏康飞（第一作者）

● 香港中文大学生物信息与遗传学硕士。

● 长期从事生物信息技术在复杂疾病、罕见病、肿瘤、微生物感染等领域的应用研究及数据挖掘工作，目前研究的主要方向为微生物组分析工具及临床病原微生物检测优化。

官远林（通讯作者）

● 予果生物副总经理，北安普顿大学（英国）工商管理硕士，华南理工大学软件工程学士，陕西省秦创原青年科技人才，广东省广州市 2013 年度盐田区生物产业高层次人才的“高级人才”。

● 全面负责公司生物信息分析、病原微生物数据开发、基于人工智能的数据库机器学习、产品生物信息测序数据分析等科技创新战略制定及技术研发实施。曾负责新英格兰杂志病原微生物文章的分析，发表两篇文章影响因子分别为38.138和59.558。

林铨振（通讯作者）

● 香港科技大学教授。

● 主要研究方向眼和大脑健康，医学大数据指标，穿戴式生物医疗传感器，腔内技术和设备。主持项目超过8000万，在医疗器械领域有多项临床阶段成果。

杨军波（通讯作者）

● 副研究员。中科院遗传所博士，北京大学博士后，中国农业科学院深圳农业基因组研究所博士后。

● 目前研究的主要课题为遗传学，微生物组学，表观遗传学和生物信息学等方向。

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“iMeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百位华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表原创研究、方法和综述以促进宏基因组学、微生物组和生物信息学发展。目标是发表前10%(IF > 15)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、前3年免出版费、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！

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