LUC项目文章|14-3-3蛋白BdGF14a增加了BdbZIP62的转录调控活性，从而在烟草中赋予了抗旱和抗盐能力

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在近期的文章《干货！如何验证转录因子与靶基因启动子互作？》中，我们介绍了几种验证转录因子与靶基因启动子互作的方法：ChIP-qPCR、双荧光素酶报告实验（LUC）、酵母单杂交（Y1H）点对点验证和凝胶阻滞实验EMSA。通常文章会选择2种及以上技术手段进行验证，同时考虑兼顾体内验证和体外验证，在实际应用中，可以根据实验目的和样品特点选择合适的方法。今天，我们带来一篇新出炉的LUC客户文章，帮大家进一步理解“验证转录因子与靶基因启动子互作”的方法。

2024年1月15日，河南科技学院的研究团队在期刊plants（IF=4.5）发表题为“The 14-3-3 Protein BdGF14a Increases the Transcriptional Regulation Activity of BdbZIP62 to Confer Drought and Salt Resistance in Tobacco”的研究论文。在该研究中鉴定到一个二穗短柄草（Brachypodium distachyon）的14-3-3基因——BdGF14a，发现它可以赋予烟草对干旱和盐碱的耐受性，并且通过酵母单杂交和LUC验证了BdGF14a能增强NtABF2和BdbZIP62的转录调控活性。爱基百客为该研究提供LUC的技术支持。

  研究背景  

一组被称为14-3-3s的调节蛋白最近被证明在对非生物胁迫的反应中发挥了重要的作用。它在种间和种内高度保守，参与植物的生长发育、光信号转导和激素调控。尽管14-3-3s在非生物胁迫功能阐释已有较多进展，但麦类模式植物“二穗短柄草”只有2个14-3-3基因在非生物胁迫响应中进行了功能研究。此外，到目前为止，关于14-3-3s在提供抗盐和干旱胁迫方面的作用的报道数量有限。

  研究思路  

  研究结果  

1. BdGF14a特征分析和转基因烟草生理表型分析

该研究鉴定到一个来自二穗短柄草的14-3-3 基因Bradi1g11290.1，根据蛋白同源性将其命名为“BdGF14a”。qRT-PCR的结果显示BdGF14a的表达受到多种胁迫（受盐、H2O2和脱落酸(ABA)）的诱导，亚细胞定位显示其在整个洋葱细胞中均有表达。将基因BdGF14a在烟草异源表达，然后观察其表型。结果显示，BdGF14a能够提高烟草对干旱和盐碱的耐受性。

图：BdGF14a有助于转基因烟草对盐和干旱的耐受性

图：对照和BdGF14a转基因植物在干旱和盐胁迫下的生理指标

研究对胁迫相关基因进行了表达分析，发现BdGF14a可以调控胁迫相关基因的表达，增强耐盐和耐旱性，而这些基因的上调依赖于ABA。

图：BdGF14a转基因烟草在干旱和盐胁迫条件下，补充或不补充0.1毫摩尔的钨酸钠（Tu）处理五天后，参与ROS清除的基因的表达模式

此外，研究还测量了气孔的宽/长比，结果表明，BdGF14a转基因烟草提高了气孔关闭速度，减少了水分流失，提高了对盐和干旱的耐受性。

图：BdGF14a在盐和干旱处理下调节气孔运动，增加ABA敏感性

2. BdGF14a与NtABF2相互作用，调控ABA相关基因的表达

为了更好地揭示BdGF14a赋予的对盐和干旱的耐受性的分子基础，研究分析了选定的ABA相关基因的转录水平。研究分析了在正常调节、干旱和盐胁迫下，NtLEA5、NtNCED1、NtABF2、NtTobLTP1、NtDRE3和NtERD10C/D基因的表达水平。根据文献，作者推测  BdGF14a能够调控NtNCED1的表达，它是ABF2潜在的靶标。因此，进行酵母双杂交和酵母单杂交检测NtABF2和BdGF14a/ABRE顺式作用元件之间的互作。正如预期，NtABF2与BdGF14a互作。

图：BdGF14a在酵母双杂交实验中与NtABF2互作，并调控ABA相关基因的表达。

3. BdbZIP62与BdGF14a相互作用，正调控对干旱和盐胁迫的响应。

BdbZIP62（Bradi3g57960.1）是NtABF2的同源蛋白，是ABRE依赖的ABA信号通路的重要转录调节因子，参与植物对非生物胁迫的应答。在研究团队的一项先前研究中，发现BdbZIP62与BdGF14a发生相互作用。为了确定BdbZIP62在BdGF14a依赖的胁迫响应中的功能，首先使用qRT-PCR验证BdbZIP62在不同组织和处理的表达情况，它在所有组织均有表达，在根和叶子中表达最高。另外，它也受到胁迫诱导。综合这些发现，BdbZIP62类似于BdGF14a，对盐度和干旱敏感，这可能涉及ABA和H2O2依赖的信号通路。

同样将BdbZIP62在烟草中表达，获得稳定转化的T3代转基因烟草，研究了BdbZIP62在应对非生物胁迫中的表型。观察了表达BdbZIP62的烟草植株对干旱和盐条件的表型响应。结果表明类似于BdGF14a，在干旱和盐胁迫条件下，BdbZIP62过表达烟草的存活率分别比野生型和对照组高出15-31.2%和14.8-33.2%。研究还检测了水分流失率、植物耐受性相关生理指标。此外，BdbZIP62降低非生物胁迫下的气孔，增加转基因烟草的ABA敏感性。

图：过表达BdbZIP62的转基因烟草表现出了对干旱和盐胁迫的抗性

图：BdbZIP62在盐胁迫和干旱处理以及ABA反应下调节气孔运动。

4. BdGF14a增强了NtABF2和BdbZIP62的转录调控活性

前面研究结果显示NtABF2通过结合ABRE顺式调控元件与BdGF14a互作，并且在非生物胁迫下，表达BdGF14a的烟草中，ABA相关基因中NtNCED1的表达上调最高。ABRE顺式元件位于NtNCED1基因上游5’-UTR区域。研究团队进行了双荧光素酶报告基因(LUC)实验，以验证NtABF2的转录调节激活和BdGF4a对结合的影响。

NtNCED1作为靶标的94 bp启动子片段如下图A，用于LUC检测的载体构建物的草图如下图B，实验用LUC/REN比值以评估转录活性，并以共转化的pGreenII 62-SK空载体和pNtNECD1-LUC作为对照，设为1。结果表明，NtABF2可以激活pNtNECD1-LUC（下图C和D）。同时，与单独表达pGreenII 62-SK-NtABF2相比，pGreenII 62-SK-BdGF14a和pGreenII 62-SK-NtABF2与pNtNECD1-LUC共同表达，明显改善了LUC/REN比率（下图C和D）。这些观察结果表明，BdGF14a可以增加NtABF2的转录调控活性，表明NtABF2确实可以通过与其启动子中的ABRE顺式作用元件结合来激活NtNECD1的表达，而BdGF14a可以通过与NtABF2相互作用来促进NtABF2的活性。这些结果表明，BdGF14a通过与NtABF2结合并增强其转录调控活性，从而上调与ABA信号通路相关的含有ABRE顺式作用元件的基因的表达，提高了对盐胁迫和干旱的抗性。

图：BdGF14a增强了NtABF2和BdbZIP62的转录调控活性

BdbZIP62是二穗短柄草种NtABF2的同源基因。因此，查明BdbZIP62是否调控转录活性以及BdGF14a能否影响这种能力。因此，使用酵母单杂交（Y1H）检测BdbZIP62对ABRE顺式作用元件的调控作用。此外，通过LUC（荧光素酶报告基因）实验进一步验证了BdbZIP62与NtNCED1启动子的相互作用，以及BdGF4a对结合的影响。结果显示BdbZIP62能激活pNtNECD1-LUC，并且相比单独表达pGreenII 62-SK-BdbZIP62，共表达pGreenII 62-SK-BdGF14a和带pNtNECD1-LUC的pGreenII 62-SK-BdbZIP62导致更高的LUC/REN比率，这表明，类似于NtABF2，共表达BdGF14a也能通过与其ABRE顺式作用元件结合，增加BdbZIP62对NtNECD1的转录调控活性。然而，在mpNtNECD1-LUC（缺乏ABRE顺式元件）对中检测到较低的LUC/REN比值。以上结果表明，BdbZIP62对NtNECD1的转录激活活性部分具有ABRE顺式元件特异性，而BdGF4a也可以通过与BdbZIP62相互作用促进转录激活活性。

  总   结   

该研究鉴定到一个二穗短柄草的BdGF14a基因，受到H2O2、盐和ABA的诱导；构建转基因烟草，发现其可以赋予烟草对干旱和盐碱的耐受性，表现为更高的存活率和更长的根系。然后，研究分析转基因烟草多个表型生理指标，并分析了ABA相关的基因表达情况。然后利用酵母单杂交确定了BdGF14a与NtABF2相互作用并调节与胁迫相关的基因表达。基于同源分析和前期研究，确定BdbZIP62为进一步研究对象，并构建其转基因烟草植株，分析其表型和生理指标。最后，研究利用Y1H和LUC实验，确定了BdGF14a能增强NtABF2和BdbZIP62的转录调控活性，通过结合ABRE顺式元件靶向NtNECD1。因此，BdGF14a通过与BdbZIP62相互作用，增强其通过ABA介导的信号传导途径的转录调控活性，从而赋予植物对干旱和盐碱的抗性。

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