LUC项目文章|14-3-3蛋白BdGF14a增加了BdbZIP62的转录调控活性,从而在烟草中赋予了抗旱和抗盐能力

本文主要是介绍LUC项目文章|14-3-3蛋白BdGF14a增加了BdbZIP62的转录调控活性,从而在烟草中赋予了抗旱和抗盐能力,希望对大家解决编程问题提供一定的参考价值,需要的开发者们随着小编来一起学习吧!

在近期的文章《干货!如何验证转录因子与靶基因启动子互作?》中,我们介绍了几种验证转录因子与靶基因启动子互作的方法:ChIP-qPCR、双荧光素酶报告实验(LUC)、酵母单杂交(Y1H)点对点验证和凝胶阻滞实验EMSA。通常文章会选择2种及以上技术手段进行验证,同时考虑兼顾体内验证和体外验证,在实际应用中,可以根据实验目的和样品特点选择合适的方法。今天,我们带来一篇新出炉的LUC客户文章,帮大家进一步理解“验证转录因子与靶基因启动子互作”的方法。

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2024年1月15日,河南科技学院的研究团队在期刊plants(IF=4.5)发表题为“The 14-3-3 Protein BdGF14a Increases the Transcriptional Regulation Activity of BdbZIP62 to Confer Drought and Salt Resistance in Tobacco”的研究论文。在该研究中鉴定到一个二穗短柄草(Brachypodium distachyon)的14-3-3基因——BdGF14a,发现它可以赋予烟草对干旱和盐碱的耐受性,并且通过酵母单杂交和LUC验证了BdGF14a能增强NtABF2和BdbZIP62的转录调控活性。爱基百客为该研究提供LUC的技术支持

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  研究背景  

一组被称为14-3-3s的调节蛋白最近被证明在对非生物胁迫的反应中发挥了重要的作用。它在种间和种内高度保守,参与植物的生长发育、光信号转导和激素调控。尽管14-3-3s在非生物胁迫功能阐释已有较多进展,但麦类模式植物“二穗短柄草”只有2个14-3-3基因在非生物胁迫响应中进行了功能研究。此外,到目前为止,关于14-3-3s在提供抗盐和干旱胁迫方面的作用的报道数量有限。

  研究思路  

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  研究结果  

1. BdGF14a特征分析和转基因烟草生理表型分析

该研究鉴定到一个来自二穗短柄草的14-3-3 基因Bradi1g11290.1,根据蛋白同源性将其命名为“BdGF14a”。qRT-PCR的结果显示BdGF14a的表达受到多种胁迫(受盐、H2O2和脱落酸(ABA))的诱导,亚细胞定位显示其在整个洋葱细胞中均有表达。将基因BdGF14a在烟草异源表达,然后观察其表型。结果显示,BdGF14a能够提高烟草对干旱和盐碱的耐受性。

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图:BdGF14a有助于转基因烟草对盐和干旱的耐受性

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图:对照和BdGF14a转基因植物在干旱和盐胁迫下的生理指标

研究对胁迫相关基因进行了表达分析,发现BdGF14a可以调控胁迫相关基因的表达,增强耐盐和耐旱性,而这些基因的上调依赖于ABA。

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图:BdGF14a转基因烟草在干旱和盐胁迫条件下,补充或不补充0.1毫摩尔的钨酸钠(Tu)处理五天后,参与ROS清除的基因的表达模式

此外,研究还测量了气孔的宽/长比,结果表明,BdGF14a转基因烟草提高了气孔关闭速度,减少了水分流失,提高了对盐和干旱的耐受性。

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图:BdGF14a在盐和干旱处理下调节气孔运动,增加ABA敏感性

2. BdGF14a与NtABF2相互作用,调控ABA相关基因的表达

为了更好地揭示BdGF14a赋予的对盐和干旱的耐受性的分子基础,研究分析了选定的ABA相关基因的转录水平。研究分析了在正常调节、干旱和盐胁迫下,NtLEA5NtNCED1NtABF2NtTobLTP1NtDRE3NtERD10C/D基因的表达水平。根据文献,作者推测  BdGF14a能够调控NtNCED1的表达,它是ABF2潜在的靶标。因此,进行酵母双杂交和酵母单杂交检测NtABF2和BdGF14a/ABRE顺式作用元件之间的互作。正如预期,NtABF2与BdGF14a互作。

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图:BdGF14a在酵母双杂交实验中与NtABF2互作,并调控ABA相关基因的表达。

3. BdbZIP62与BdGF14a相互作用,正调控对干旱和盐胁迫的响应。

BdbZIP62(Bradi3g57960.1)是NtABF2的同源蛋白,是ABRE依赖的ABA信号通路的重要转录调节因子,参与植物对非生物胁迫的应答。在研究团队的一项先前研究中,发现BdbZIP62与BdGF14a发生相互作用。为了确定BdbZIP62在BdGF14a依赖的胁迫响应中的功能,首先使用qRT-PCR验证BdbZIP62在不同组织和处理的表达情况,它在所有组织均有表达,在根和叶子中表达最高。另外,它也受到胁迫诱导。综合这些发现,BdbZIP62类似于BdGF14a,对盐度和干旱敏感,这可能涉及ABA和H2O2依赖的信号通路。

同样将BdbZIP62在烟草中表达,获得稳定转化的T3代转基因烟草,研究了BdbZIP62在应对非生物胁迫中的表型。观察了表达BdbZIP62的烟草植株对干旱和盐条件的表型响应。结果表明类似于BdGF14a,在干旱和盐胁迫条件下,BdbZIP62过表达烟草的存活率分别比野生型和对照组高出15-31.2%和14.8-33.2%。研究还检测了水分流失率、植物耐受性相关生理指标。此外,BdbZIP62降低非生物胁迫下的气孔,增加转基因烟草的ABA敏感性。

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图:过表达BdbZIP62的转基因烟草表现出了对干旱和盐胁迫的抗性

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图:BdbZIP62在盐胁迫和干旱处理以及ABA反应下调节气孔运动。

4. BdGF14a增强了NtABF2和BdbZIP62的转录调控活性

前面研究结果显示NtABF2通过结合ABRE顺式调控元件与BdGF14a互作,并且在非生物胁迫下,表达BdGF14a的烟草中,ABA相关基因中NtNCED1的表达上调最高。ABRE顺式元件位于NtNCED1基因上游5’-UTR区域。研究团队进行了双荧光素酶报告基因(LUC)实验,以验证NtABF2的转录调节激活和BdGF4a对结合的影响

NtNCED1作为靶标的94 bp启动子片段如下图A,用于LUC检测的载体构建物的草图如下图B,实验用LUC/REN比值以评估转录活性,并以共转化的pGreenII 62-SK空载体和pNtNECD1-LUC作为对照,设为1。结果表明,NtABF2可以激活pNtNECD1-LUC(下图C和D)。同时,与单独表达pGreenII 62-SK-NtABF2相比,pGreenII 62-SK-BdGF14a和pGreenII 62-SK-NtABF2与pNtNECD1-LUC共同表达,明显改善了LUC/REN比率(下图C和D)。这些观察结果表明,BdGF14a可以增加NtABF2的转录调控活性,表明NtABF2确实可以通过与其启动子中的ABRE顺式作用元件结合来激活NtNECD1的表达,而BdGF14a可以通过与NtABF2相互作用来促进NtABF2的活性。这些结果表明,BdGF14a通过与NtABF2结合并增强其转录调控活性,从而上调与ABA信号通路相关的含有ABRE顺式作用元件的基因的表达,提高了对盐胁迫和干旱的抗性。

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图:BdGF14a增强了NtABF2和BdbZIP62的转录调控活性

BdbZIP62是二穗短柄草种NtABF2的同源基因。因此,查明BdbZIP62是否调控转录活性以及BdGF14a能否影响这种能力。因此,使用酵母单杂交(Y1H)检测BdbZIP62对ABRE顺式作用元件的调控作用。此外,通过LUC(荧光素酶报告基因)实验进一步验证了BdbZIP62与NtNCED1启动子的相互作用,以及BdGF4a对结合的影响。结果显示BdbZIP62能激活pNtNECD1-LUC,并且相比单独表达pGreenII 62-SK-BdbZIP62,共表达pGreenII 62-SK-BdGF14a和带pNtNECD1-LUC的pGreenII 62-SK-BdbZIP62导致更高的LUC/REN比率,这表明,类似于NtABF2,共表达BdGF14a也能通过与其ABRE顺式作用元件结合,增加BdbZIP62对NtNECD1的转录调控活性。然而,在mpNtNECD1-LUC(缺乏ABRE顺式元件)对中检测到较低的LUC/REN比值。以上结果表明,BdbZIP62对NtNECD1的转录激活活性部分具有ABRE顺式元件特异性,而BdGF4a也可以通过与BdbZIP62相互作用促进转录激活活性。

  总   结   

该研究鉴定到一个二穗短柄草的BdGF14a基因,受到H2O2、盐和ABA的诱导;构建转基因烟草,发现其可以赋予烟草对干旱和盐碱的耐受性,表现为更高的存活率和更长的根系。然后,研究分析转基因烟草多个表型生理指标,并分析了ABA相关的基因表达情况。然后利用酵母单杂交确定了BdGF14a与NtABF2相互作用并调节与胁迫相关的基因表达。基于同源分析和前期研究,确定BdbZIP62为进一步研究对象,并构建其转基因烟草植株,分析其表型和生理指标。最后,研究利用Y1H和LUC实验,确定了BdGF14a能增强NtABF2和BdbZIP62的转录调控活性,通过结合ABRE顺式元件靶向NtNECD1。因此,BdGF14a通过与BdbZIP62相互作用,增强其通过ABA介导的信号传导途径的转录调控活性,从而赋予植物对干旱和盐碱的抗性。

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