eBioMedicine | 北大人民医院王辉组开展大队列纳米孔测序快速鉴定下呼吸道感染病原临床研究...

靶向和无偏宏基因组结合的双流程纳米孔测序技术能够快速准确诊断下呼吸道感染

A dual-process of targeted and unbiased Nanopore sequencing enables accurate and rapid diagnosis of lower respiratory infections

Article，2023-11-03，eBioMedicine，[IF 11]

DOI：https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2023.104858

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352396423004243?via%3Dihub

第一作者：Yifan Guo（郭一凡）；Zhenzhong Li（李振中）

通讯作者：Hui Wang（王辉）；Hao Guo（郭昊）

主要单位：

北京大学人民医院（Department of Clinical Laboratory, Peking University People’s Hospital, Beijing, China）

北京大学医学技术研究院（Institute of Medical Technology, Peking University Health Science Center, Beijing, China）

江苏先声诊断医学有限公司（State Key Laboratory of Translational Medicine and Innovative Drug Development, Jiangsu Simcere Diagnostics Co., Ltd., Nanjing,China）

南京先声医学检验实验室有限公司（Nanjing Simcere Medical Laboratory Science Co., Ltd., Nanjing, China）

中日友好医院（Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Laboratory of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, National Center for Clinical Research on Respiratory Diseases, China-Japan Friendship Hospital, Beijing, China）

首都医科大学附属北京朝阳医院（Department of Infectious Diseases and Clinical Microbiology, Beijing Institute of Respiratory Medicine and Beijing Chao Yang Hospital, Capital Medical University, Beijing, China）

- 摘要 -

Background 纳米孔宏基因组学已被用于细菌病原体的感染疾病诊断。然而，这项技术目前在临床环境中对细菌、真菌、和病毒的检出性能尚缺乏全面的研究。

Methods 我们开发了一种用于单样本的双流程纳米孔测序技术，该技术在宏流程中进行无偏好的宏基因组学研究，在靶向流程中进行靶向富集（纳米孔Meta-Panel流程，NanoMP），并前瞻性地从多中心收集了450例下呼吸道标本。基于21种物种的正交实验，通过机器学习和ROC曲线建立的过滤体系提高对病原检测的准确性。基于CARD数据库和SNP矩阵算法鉴定耐药基因（AMR）。

Findings 宏流程对细菌、真菌（除曲霉属）和结核分枝杆菌组的检出分别达到82.9%、88.7%和75.0%的高灵敏度。与宏流程相比，靶向流程的扩增提高了病毒（>80.0% vs. 39.4%）和曲霉属（81.8% vs. 42.3%）检测的灵敏度。与复合标准相比，NanoMP总体实现了80.2%的灵敏度和98.8%的特异性，并且能够准确检测包括blaKPC-2、blaOXA-23和mecA在内AMR基因并能够进行溯源。

Interpretation 我们开发了宏基因组和靶向富集相结合的纳米孔测序技术NanoMP对同一个样本进行细菌、真菌和病毒的检测分析，并且在真实的临床环境中展现出良好的诊断性能。

- 前言 -

下呼吸道感染（LRTIs）包括社区获得性肺炎（CAP）、医院获得性肺炎（HAP）和呼吸机相关性肺炎（VAP），这些疾病导致超过25%的肺炎相关住院死亡。然而，由于现有检测病原方法的局限性，对如细菌、真菌、病毒和非典型病原体等的检测仍具有挑战。

最近，在临床宏基因组测序技术迅速从实验室应用到临床的过程中，纳米孔测序的实时性和长读长，都更适合临床的需求，特别是对AMR基因的检测。现有的研究大多集中在细菌和真菌检测上，特别是很少有同时涵盖细菌、真菌和病毒检测的大队列临床研究。而且临床宏基因组包含很多混杂因素，如污染和大量的人类DNA背景，不同的研究也采用了不同的过滤指标，得到的性能也参次不齐，限制了该方法在临床上的推广应用。

为了满足临床应用需求，我们提出了一种基于双条码体系结合无偏宏基因组（Meta流程）和靶向扩增（Panel流程）的纳米孔Meta-Panel双流程（NanoMP）。利用人群中常见的DNA病毒（HSV1、EBV和CMV）以及曲霉菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）和RNA病毒（鼻病毒Rhv），用于Panel流程的方法学评估。我们进行了一项迄今为止最大的前瞻性研究，收集了来自418名患者的450例样本来评估NanoMP方法在真实临床应用中的性能，并利用多指标的机器学习模型和ROC曲线建立过滤体系，进一步的能够识别耐药基因以及亚型，首次建立起病原水平的方法学性能评价和样本水平的临床性能评价结合的两级性能评价体系，更符合临床宏基因组学在临床应用的真实性能。

- 结果 -

1. 病人特征

在这项前瞻性研究中，收集并纳入了418名患者的450例样本（348个支气管肺泡灌洗液和102个痰液样本）。根据社区获得性肺炎（CAP）、医院获得性肺炎（HAP）的标准以及临床专家对疑似感染的意见，这些患者被分为下呼吸道感染组（LRTI，n=249）和非下呼吸道感染组（non-LRTI，n=169）。如表1所示，有吸入史、侵入性机械通气和免疫抑制状态的发生率在LRTI组中较高；在LRTI患者中检测到发热、痰液和呼吸困难的患病率较高；非LRTI组中恶性肿瘤的患病率较高，但血液病患者的数量较少。

2. 检测限

检测限（LoD）是通过使用未感染的NRF BALF样本来确定的，这些样本被加入了已知细胞浓度的10倍梯度稀释的微生物（铜绿假单胞菌P. aeruginosa、金黄色葡萄球菌S. aureus、曲霉A. fumigatus、巨细胞病毒CMV、鼻病毒Rhv）进行10次重复实验。背景菌水平可能导致了不同的细菌LoDs。与Meta流程相比，Panel流程提高了A. fumigatus和CMV的LoDs。

3. NanoMP流程特征

每个Run包含6个样本和5个阴性对照（Meta流程中包含宿主去除[NC1]、DNA提取[NC2]和文库制备[NC3]的对照；Panel流程中包含DNA/RNA提取[NC2]和文库制备[NC3]的对照），整个TAT为6.5-7.0h（图1），其中核酸提取（2h，双流程）、文库制备（3.5-4.0h，双流程）、测序和分析（~1h）。

图1：本研究的流程示意图、

共采集418名疑似肺部感染患者的450份痰液/BALF样本，微生物学测试包括培养、qPCR、ELISA、GeneXpert MTB/RIF和组织病理学。所有样本均分为Meta流程和Panel流程。这两个混库后一起测序后进行生物信息学分析，最终的物种鉴定是与金标准的比较得到的过滤体系，依据临床判断做出病原报告。

4. Meta流程过滤体系的建立和检测性能

病原水平的总数据集（细菌组972个和病毒组270个）用来训练和测试XGBoost分类器。对于细菌组，XGBoost分类器在训练数据集的AUC为0.915（95% CI，0.894-0.916）；而在测试数据集为0.923（95% CI，0.897-0.931）。对于病毒组，训练数据集的AUC为0.817（95% CI，0.772-0.811），而在测试数据集为0.793（95% CI，0.726-0.805）（图2）。

根据细菌和病毒组训练的最终模型，两组的AUC分别为0.916和0.809（图2）。与临床和正交检测的金标准结果相比，XGBoost分类器在细菌组的敏感性和特异性分别为84.8%和82.9%，在病毒组分别为81.0%和67.2%（图2）。

对于真菌（除曲霉外）、结核分枝杆菌（MTB）和曲霉组，通过相关性分析确定了Reads和Ratio_run两个指标，并且基于ROC曲线建立阈值，其AUC分别为0.94、0.87和0.71（图2）。

为了比较不同过滤方法在细菌和病毒组中的性能，基于上述方法对细菌和病毒组选择Reads和Ratio_run指标进行ROC分析。在细菌组中敏感性和特异性分别为71.6%的和69.3%性，病毒组中分别为48.6%和77.1%。使用XGBoost分类器检测到细菌组的高敏感性和两个组均有高特异性（图2）。基于XGBoost分类器，两个组的敏感性均>80%，表明通过机器学习可以用来建立过滤体系。考虑到漏检的微生物，细菌组具有优异的敏感性和特异性分别为82.9%和82.9%（图3a）。然而，在病毒组大量的漏检结果，敏感性为39.4%（图3a）。对于ROC分析，真菌组（除曲霉属外）的敏感性和特异性分别为88.7%和97.1%，结核分枝杆菌（MTB）的敏感性和特异性分别为75.0%和99.8%，曲霉属组的敏感性为42.3%（图3b）。

图2：构建过滤体系流程

对于Meta流程中的细菌和病毒组，使用LASSO选择候选特征。将候选特征数据集分为训练集/测试集，并通过分层交叉验证调整XGBoost模型的超参数。ROC曲线用于评估具有最佳超参数模型的性能。对于Meta流程中的真菌（除曲霉属）、MTB和曲霉属和在Panel流程中的HSV1、EBV、CMV、鼻病毒和烟曲霉，均根据Spearman相关系数挑选最佳指标，然后通过ROC曲线根据最大Youden指数设置最佳阈值。

5. Panel流程提升了特定病原的检测性能

根据EBV、CMV、HSV1、A. fumigatus和Rhv在Panel流程中相关性分析得到的最佳指标和ROC分析，AUC分别为0.86、0.86、0.94、0.91和0.99（图2）。HSV1的敏感性和特异性分别为92.1%和91.3%，EBV的为84.0%和79.9%，CMV的为81.5%和86.0%，A. fumigatus的为81.8%和99.8%，而Rhv的为100.0%和97.5%（图3c）。

图3：基于金标准和评分系统的纳米孔测序方法学性能

(a）增加了漏检病原体的细菌和病毒组的检测性能。(b）在Meta流程中使用具有95%CI的ROC曲线和真菌（除曲霉）、MTB和曲霉组的最佳性能。(c）Panel流程中使用95%CI的ROC曲线和HSV1、EBV、CMV、鼻病毒和曲霉的最佳性能。

6. 基于临床判断的纳米孔测序性能

450例样本中有149个（33.1%） 培养呈阳性（图4a），而基于培养和其他微生物学检测，阳性结果增加到195个（43.3%） 样本（图4b）。纳米孔测序鉴定出224个（49.8%） 样本含有确定或可能的病原体。总体而言，与培养结果相比，纳米孔测序具有89.9%的临床敏感性和71.8%的临床特异性。此外，有45个样本的其他微生物学检测呈阳性，因此与所有微生物学检测相比，其临床敏感性为91.8%，临床特异性为83.9%。与复合标准相比，纳米孔测序具有80.2%的临床敏感性和98.8%的临床特异性（图4b）。

7. 耐药基因检测

纳米孔测序已经被用于在先前的研究中用于AMR基因检测。因此，我们构建了一个SNPM数据库来检测AMR基因及其亚型，这些亚型也可以依靠长读长追踪到相应的微生物（图4c）。在已培养的病原体中，选择了在培养结果中高检出并给临床带来重负担的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）、鲍曼不动杆菌（A. baumannii）、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae） 和金黄色葡萄球菌（S. aureus） 来分析AMR基因（图4a）。如图4d所示，我们在P. aeruginosa中鉴定到16个样本含有blaOXA（15个类blaOXA-50和1个blaOXA），在A. baumannii中鉴定到15个样本含有blaOXA（12个blaOXA-66、12个blaOXA-23和4个blaOXA），在S. aureus中鉴定到4个样本含有mecA，在K. pneumoniae中鉴定到5个样本含有blaKPC-2。在临床抗生素敏感性测试中，对于碳青霉烯类抗生素耐药的P. aeruginosa、A. baumannii、K. pneumoniae以及甲氧西林耐药的S. aureus，一致性分别为78.6%、83.3%、62.5%和100%。总体而言，这些数据表明纳米孔测序在临床中AMR基因鉴定和溯源耐药基因宿主的良好性能。

图4：基于临床判断的纳米孔测序病原体检测和AMR基因鉴定的性能

(a）临床培养结果分布。(b）纳米孔测序相对于临床培养、所有微生物检测和复合标准的性能。(c）AMR基因鉴定及其溯源的流程。(d）基于纳米孔测序的AMR基因检测性能。

- 讨论 -

在这项前瞻性大队列研究中，我们使用了450例临床呼吸道样本来评估纳米孔测序检测感染病原体的性能，建立了一种Dual-barcode的涵盖DNA/RNA病原体检测的NanoMP方法。利用机器学习和ROC曲线建立可用于临床样本的病原检测过滤体系并有望扩展到其他研究中。同时根据临床结果，也评估了基于SNPM数据库建立的AMR基因检测方法的临床检测性能。本次通过涵盖细菌、真菌和病毒以及AMR基因检测的多中心、大队列临床研究，和建立的病原水平的方法学性能评价和样本水平的临床性能评价的两级性能评价体系，更能反应出纳米孔测序的真实临床应用表现。

参考文献

Yifan Guo, Zhenzhong Li, Lijuan Li, Shan Li, Lingxiao Sun, Xinfang Yang, Yan Dai, Ju Gu, Lan Yang, Xue Liu, Binghuai Lu, Jiajing Han, Kang Chang, Li Gu, Yuyao Yin, Shijun Sun, Chendi Jing, Hongbin Chen, Manjiao Liu, Hui Xu, Ryon Liu, Yong Ren, Hao Guo, Hui Wang.  A dual-process of targeted and unbiased Nanopore sequencing enables accurate and rapid diagnosis of lower respiratory infections. eBioMedicine, Volume 98, 2023, 104858, ISSN 2352-3964, https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2023.104858.

- 作者简介 -

第一作者

北京大学人民医院检验科

郭一凡

博士、助理研究员

研究方向：宏基因组测序技术在肺部感染诊断中的应用与优化。作为第一作者/共同第一作者，已发表SCI论文6篇，包括EBioMedicine、Emerg Infect Dis等，累计影响因子60.8分。完成国家重大专项1项，申请国家自然科学基金青年项目一项。

江苏先声诊断医学有限公司

李振中

生信总监

长期从事二三代高通量测序和机器学习在临床的应用，北京大因生物创始人，专注于临床多组学科研服务和平台开发。共完成科技部重点研发计划2项、国自然重大课题1项，申请国内外专利12项，在eBioMidicine、CTM等期刊发表SCI论文6篇。

通讯作者

江苏先声诊断医学有限公司

郭昊

生信高级总监

先声诊断科研&生信高级总监，本科毕业于清华大学，军事医学科学院生化与分子生物学博士，第四军医大学临床医学博士后。中国自动化学会智能健康与生物信息专业委员会委员，中国抗癌协会整合肿瘤学分会青年委员。长期从事肿瘤多组学整合分析、肿瘤早筛和免疫治疗标志物发现、肿瘤大数据平台建设等研究工作。

北大人民医院检验科

王辉

主任、医学博士、教授

北大人民医院检验科主任、北大医学部检验学系主任，国家杰青、国家卫健委突贡专家，中国医促会临床微生物分会主任委员、中华医学会检验分会常委、中华医学会微生物学和免疫学分会常委兼临床微生物学组组长，主持多项科技部重点研发计划、国自然重大课题、国自然耐药专项、面上课题等。担任Microbiology Spectrum杂志高级编委，JGAR、J Microb Immuo Infect、Science Bulletin等杂志编委，发表论文400多篇，研究方向：感染性疾病诊断、细菌耐药机制研究。

王辉实验室主页：http://www.wanghuilab.net/

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