PROTAC检测板试剂盒测定实例分析

LifeSensors的PROTAC检测板试剂盒用于泛素化的相对测定PROTAC处理后细胞裂解物中靶蛋白的表达。此检测旨在取代更费力的半定量蛋白质印迹方法来检测多泛素化和靶蛋白在细胞中的降解，并提供定量和可重复的结果。此外，该测定允许高通量筛选以处理化合物文库和建立秩序效价帮助化学家建立SAR。这块板是为研究而设计的仅使用，不用于人类或动物的诊断或治疗应用。

艾美捷PROTAC检测板试剂盒#LSS-PA-0950-0096检测原理：

Assay Plate是一种基于三明治的检测方法，其中来自细胞裂解物被捕获在预涂微量滴定板的孔中，使用专有的多泛素结合试剂。未被多泛素化/未结合的蛋白质通过洗涤，然后加入针对靶蛋白的抗体，然后洗涤。最后，使用与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的第二抗体来测量

结合的目标抗体与检测试剂和发光微孔板读取器。

PROTAC检测板试剂盒组件：

涂层板： 一个预包被和封闭的 96 孔试纸 PROTAC 检测板（储存在 -80°C)

封闭浓缩物（BC）： 12 mL 用于抗体稀释的 5X 封闭剂（储存在 4°C)

塑料板密封： 双板密封

检测试剂 1 （DR1）： 1.0 mL DR1 试剂瓶（储存在 4°C)

检测试剂 2 （DR2）： 1.0 mL DR2 试剂瓶（储存在 4°C)

MG132： 25 μL 小瓶（DMSO 中为 10 mM;储存在 -20°C)

PR-619： 25 μL 小瓶（DMSO 中为 22 mM;储存在 -20°C)

1，10-菲咯啉： 100 μL 小瓶（DMSO 中为 500 mM;储存在 -20°C)

协议：

1.从冰箱中取出盘子，从冰箱中取下试剂，使其达到室温（RT）。所有孵育均在室温（22°-27°C）下进行。为避免交叉污染，请勿重复使用铭牌密封剂。

2.制备细胞裂解物，并使用用PBS稀释的15-20µg/孔（Vt=50-100µl/孔）。

3.在室温下摇动培养板2小时。

4.带PBST的洗涤板（4 x 180mL/井）。最后一次洗涤后，轻轻去除最后一滴缓冲液在纸巾或其他吸墨纸上轻拍盘子（倒置）。不允许井完全干燥。

5.在1x封闭剂中稀释一次抗体（稀释取决于一次抗体的效率；良好开始稀释为1µg/mL），加入50-100µL/孔，并在室温下振荡培养板1小时。

6. 按照上述步骤重复洗涤（参见步骤4）。

7. 在1x封闭剂中稀释第二HRP缀合的抗体（根据制造商），加入50-100µL/孔，在室温下摇动培养板1小时。

8. 按照上述步骤重复洗涤（参见步骤4）。

9. 使用前，将800µL DR1和800µL DR 2混合到10 mL超纯水（去离子或蒸馏）。向每个孔中添加50-100µL该溶液，并使用针对化学发光5-10次，间隔1分钟。

注意事项：

1.为了监测目标蛋白的多泛素化及其降解，并且在PROTAC的Dmax之后。

2.通过蛋白质印迹优化抗体稀释度和靶蛋白的特异性。目标的选择抗体应该适用于基于夹心ELISA的测定。

3.根据目标丰度优化裂解物浓度。

4.参见下面建议的裂解缓冲液，以具有目标蛋白的最佳多泛素化谱。

5.包括最佳结果和解释的适当控制

细胞裂解方案：

1.完全吸取培养基，并用冰冷的1X PBS冲洗细胞。用1X适当刮除单元格PBS，离心以沉淀细胞并除去PBS。

2.在-80°C下冷冻细胞沉淀以长期储存或在冰上进行裂解。

3.加入RIPA裂解缓冲液（颗粒体积的5-10倍，即100mL颗粒添加500-1000µL裂解缓冲器）。间歇性涡旋10-15分钟，同时将样品保持在冰上以进行有效的裂解。

4.在4°C下以13000 xg离心15-20分钟。

5.收集上清液（裂解物）并使用标准方法测定蛋白质浓度。

PROTAC检测板试剂盒测定实例：

图1：（A） Jurkat细胞未经处理（DMSO）或用dBET1 PROTAC（0.01-12.0μM）处理45分钟。按照PROTAC测定板。结果表示为平均化学发光度的倍数变化±标准偏差（n=3）。

（B） 对如（A）中处理的Jurkat细胞的细胞裂解物（25μg）进行BRD3和β-肌动蛋白的免疫印迹。蛋白酶体抑制剂MG132用作对照以防止BRD3降解。

图2：（A） 用dBET1 PROTAC（1μM）处理Jurkat细胞不同时间（0-120分钟）。细胞裂解物（15μg/孔）按照PROTAC测定板手册中所述进行处理。结果表示为平均化学发光强度的倍数变化±标准偏差（n=3）。

（B） 对如（A）中处理的Jurkat细胞的细胞裂解物（25μg）进行BRD3和β-肌动蛋白的免疫印迹。蛋白酶体抑制剂MG132用作对照以防止BRD3降解。

图3：（A-B）用PROTAC（1μM）处理K562细胞不同时间。细胞裂解物（15μg/孔）按照手册中所述进行处理PROTAC测定板（目录号PA950）。结果表示为平均化学发光度的倍数变化±标准偏差（n=3）。

（C） 对来自如（A）中处理的K562细胞的细胞裂解物（25μg）进行BTK和AURKA的免疫印迹。使用MG132作为对照（最后一条车道）。