细胞培养实战经验分享，全面指导，成为细胞培养高手

本文主要是介绍细胞培养实战经验分享，全面指导，成为细胞培养高手，希望对大家解决编程问题提供一定的参考价值，需要的开发者们随着小编来一起学习吧！

细胞不仅是生物实验的重要材料，也是生物细胞实验的基础。大多数关于药物、基因功能和疾病机制的研究都需要在细胞水平上进行解释。然而，细胞培养受人员操作和环境条件的影响很大。细胞培养中经常会遇到很多细节问题，每个问题都可能导致细胞培养失败。本文总结了细胞实验室多年来的细胞培养经验与大家分享，希望对大家的细胞培养有所帮助。

1.细胞系的身份需要明确。

由于所选细胞系的某些特性符合研究方向的设定，因此我们选择了某一细胞系进行实验。例如组织特征、疾病特征、功能特征、基因表达特征等。一旦使用了错误的细胞株，对我们研究结果的判断就会产生很大的误差和不确定性。

近几年来，许多权威机构发现，在细胞系的培养和流通过程中，存在着严重的交叉污染。据不完全统计，仅仅因为Hela细胞系统造成的污染就导致了3万多篇论文结果的准确性，而这种情况并不局限于Hela细胞。许多权威机构的研究人员发现，超过451个细胞系统已被其他细胞完全吸收，46%的细胞污染被检测到。可以看出，细胞交叉污染非常普遍。所以，在做实验之前，验证细胞株的正身是非常重要的。若是在机构内购买的细胞株，最好让供应商提供合格的STR鉴定报告。

目前，STR基因分类法是细胞交叉污染和性质鉴定最有效、最准确的方法之一，是ATCC等权威机构认可的黄金标准。不幸的是，并非所有细胞都可以通过STR进行识别。目前，只有大多数人类细胞株和45种小鼠细胞株可以进行识别。其它细胞株可结合细胞形态、特性和物种鉴定进行确认。

二、培养、传代、冻存和复苏。

1.准备工作：

根据培养细胞的特性，提前准备适当的培养基和血清。为了避免细胞在新环境下需要过渡适应，最好遵循细胞原有的培养条件。与此同时，充分了解细胞的生长特性和形态特性，便于后续的培养观察。

2.贴壁细胞的传代：

1)移除使用过的细胞培养液。(不要直接倒出，以免造成瓶口残留物污染)

2)用平衡盐溶液(PBS)冲洗细胞，不含钙镁离子。轻轻地将冲洗液从与壁细胞层相对的容器一侧加入，以免搅动细胞层，前后摇动容器数次，最后将冲洗液移除。(洗掉残留的血清，避免影响胰酶的活性。)

3）以25cm2的培养瓶为例，在瓶中加入1ml胰蛋白酶-EDTA（请根据每个细胞的指导使用适当的浓度）消化液，轻轻摇动培养瓶，使消化液在所有细胞表面流动，并在37℃下孵化。通常，在几分钟内，细胞质量会收缩，细胞间隙会增加。倾斜培养瓶时，细胞层可以自然流下。此时，应添加含有2-3ml血清的完整培养液，以终止消化（请参考每个细胞的指导方针进行细胞分离所需的时间，建议每30秒在显微镜下观察细胞分离）。此外，并非所有贴壁细胞都适合使用胰蛋白酶进行解离，请根据每个细胞的指导选择合适的解离方法。

4）倾斜培养瓶，吸收培养瓶中的液体，轻轻地冲向原细胞生长表面，重复这个动作2-3次，使所有细胞沿着瓶底流下，然后轻轻地将细胞吹成单个悬浮液（吹气过程中应避免气泡）。

PS：对难以消化的细胞，尽量不要用力吹打来处理，以免对细胞造成物理损伤。先将消化后的细胞分离出来，及时停止消化。然后再次消化仍然靠近墙壁的细胞。实现分层消化，避免胰酶消化下易消化细胞长期受损。

5)将所有细胞悬液转移到15ml离心管中，800-1000rpm离心3-5分钟后移除上清。

6)加入新的含血清完全培养液，重新悬挂成单细胞悬液。按照各种细胞指引推荐的传代比例，将细胞悬液均匀地分配到各种培养器皿中，补充新的含血清完全培养液，轻轻摇匀。

7)放入37℃孵化，第二天在显微镜下观察细胞的贴壁情况。

3.悬浮细胞的传代：

由于悬浮生长细胞不靠近墙壁，因此在传代过程中不需要使用酶消化法，而是可以直接传代或离心收集细胞后传代。

1）直接传代时，静置5-10分钟。悬浮细胞慢慢沉淀到容器底部后，吸收1/2-2/3的原始培养液，补充新鲜含血清的完整培养液，混合成细胞悬浮液。按照每个细胞指引推荐的传代比例，将细胞悬液均匀地分配到每个培养器皿中，轻轻摇匀。

2)离心传代时，将细胞和培养液一起转移到离心管内，离心时间为800-1000rpm3-5分钟。去除上清后，加入新鲜的含血清完全培养液。按照各种细胞指引推荐的传代比例，将细胞悬液均匀地分配到各种培养器皿中，补充新鲜的含血清完全培养液，轻轻摇匀。

3)放入37℃孵化，第二天在显微镜下观察细胞状况。

4.壁挂式悬浮混合细胞的传代：

首先收集悬浮细胞，然后参考“贴壁细胞传代”方法进行消化收集，一起接种培养器皿。

PS：在悬浮细胞生长过程中，对细胞密度的要求一般较高，在培养过程中最好参考指南来控制细胞密度，不能过密或过稀。

5.细胞冻结：

1)按照“细胞传代步骤”中的方法收集细胞。

2）加入细胞冷冻储存液（一般为10%DMSO+相应细胞的完整培养液），使细胞的最终密度为（5~10）×105/ml，并将其移入细胞冷冻储存管。

3)程序冷却(以需要异丙醇的Nalgene程序冷却盒为例)：4℃30min→-80℃过夜→液氮。(4℃30min一定不能省略，否则冻存液不能渗透到细胞中，容易产生冰晶，造成细胞损伤。)

6.细胞复苏：

1）取出储存的细胞。液氮挥发后，立即在37℃的水浴中轻轻摇动以快速融化（通常在2分钟内，细胞状态会随着时间的推移而受到影响）。为了避免冻存管因温差剧烈变化而爆裂，操作此步骤时请戴上防护面罩或防护目镜。

PS：冷冻细胞用干冰运输，收到后需立即放入深低温冰箱或液氮中，至少3d后再进行复苏操作。

2)转移到无菌控制台，用75%酒精擦拭冷冻存管外部。

3)将细胞悬液转移到含血清完全培养液离心管中，含血清预热10-20ml，800-1000rpm离心3-5分钟，将上清移除。

4)将含血清完全培养液重悬细胞重新加入预热后，以约(3~5)×105/ml密度接种到培养器皿中。

5)放入37℃孵化，第二天在显微镜下观察细胞状况。

三、污染防治。

1.细菌污染。

细菌污染是细胞培养中最常见的污染，主要是由于操作不慎或使用消毒不完全的耗材和试剂引入。最常见的有枯草杆菌、大肠杆菌、假单胞菌和白葡萄球菌。镜下形状为长杆状、短杆状、颗粒状等。

左边是比较典型的杆菌污染，一般杆菌会延轴快速游动，量少时培养基会澄清。右边的图片是颗粒状污染，一般培养基会浑浊或有白沙沉淀。

好氧细菌迅速增殖和分裂，培养基可在感染后24小时内浑浊；厌氧细菌在常规细胞培养条件下缓慢增殖，观察浑浊需要很长时间。

污染处理：由于抗生素在国内细胞培养中的广泛使用，污染后添加双抗体（青霉素和链霉素、Penicillin+Streptomycin）通常无效。杆菌可以用100ug/ml庆大霉素治疗一周，颗粒状细菌可以用25ug/ml环丙沙星治疗一周，效果比较好。

2.真菌污染。

烟曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白念珠菌、酵母菌等是细胞培养中最常见的污染真菌。

左边的图片是典型的霉菌污染图片，右边的图片是酵母污染，镜子下可以看到明显的发芽形态。

污染处理：可使用100ug两性霉素B/T25瓶，治疗一周。

注意：两性霉素毒性较大，需要在细胞超过50%且状态没有受到很大影响之前进行治疗。

3.支原体污染。

支原体的危害：支原体污染能改变细胞的特性。例如，一些支原体会迅速消耗培养液中的精氨酸，并与细胞竞争营养，从而减缓或停止细胞的生长；同时，支原体还可以改变细胞的酶谱和细胞膜成分，导致细胞染色体异常或细胞病理变化。上述情况会严重影响使用这些细胞进行实验的结果，导致结论不可靠。

(PCR法检测细胞上清中的支原体污染)

支原体的预防和清除：由于支原体不能直接在镜子下看到，因此需要通过PCR方法进行检测，因此污染后很难找到。建议每月对养细胞进行一次检测，并结合每周抽样检测，以便早期发现污染。对正在进行支原体去除处理的细胞，建议每周进行一次必要的检查，直到出现阴性结果，并至少维持一个月。对不同细胞进行分离处理，优先对“支原体阴性”细胞进行处理，然后对受感染的细胞进行去除处理。与此同时，所有新引进的细胞系都进行了支原体检测，以确保实验室没有新的污染。

4.预防和控制实验室细胞污染。

建立良好的规章制度对减少细胞污染有很大帮助。包括准入系统、操作规范和日常管理系统。

访问系统：包括人员和材料。人员在进入实验室前需要进行培训，并且必须符合穿着要求，如白大褂、隔离服、口罩、手套等。而且所需的物品，非一次性物品要严格消毒灭菌，而购买的物品要从正规、可靠的渠道购买。新购买的细胞在使用前应进行检测和验证。

操作规范：最好制定常规操作规范，实验室人员应遵循操作规范，不得随意更改。同时，也是培养实验人员良好的操作习惯。例如，枪头滴管吸入后，不再再次伸入培养基中吸入，一次吸入足够量的培养基。在加液时也要尽量做到悬空加液，这样可以有效地防止支原体污染和细胞交叉污染。此外，如果可能的话，一次只能操作一个细胞，最好在细胞和细胞之间有一点时间间隔，以避免交叉污染。

日常管理制度：包括使用、清洁、维护等各方面的规则、方法，如环境和耗材试剂。还有试剂耗材等的消耗、库存和采购管理，包括细胞样品的二级库存管理。对难以发现的污染源，最好定期检测，主要是支原体污染和细胞交叉污染。