NC | 俄亥俄州立于忠堂组系统性揭示瘤胃生态系统中的病毒暗物质

Article，2023-8-29，Nature communications，[IF 16.6]

DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-023-41075-2

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-41075-2

第一作者：Ming Yan （严鸣)

通讯作者：Zhongtang Yu （于忠堂）

合作作者：Akbar Adjie Pratama, Sripoorna Somasundaram, Zongjun Li（李宗军） , Yu Jiang （姜雨） , Matthew B. Sullivan

主要单位：

美国俄亥俄州立大学动物科学学院 （Department of Animal Sciences, The Ohio State University, Columbus, OH, USA)

美国俄亥俄州立大学微生物组研究中心 （Center of Microbiome Science, The Ohio State University, Columbus, OH, USA)

合作单位：

美国俄亥俄州立大学微生物学院 （Department of Microbiology, The Ohio State University, Columbus, OH, USA）

西北农林科技大学动物科技学院（College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling, China）

2023年8月29日，美国俄亥俄州立大学动物科学学院以及微生物组研究中心的Zhongtang Yu教授团队在《Nature communications》上发表了题为Interrogating the viral dark matter of the rumen ecosystem with a global virome database的研究论文。

- 研究背景 -

瘤胃微生物组的细菌以及原核与真核生物组共同作用将哺乳动物无法利用的高纤维植物成分转化为可利用的能量来源，同时提供高质量的微生物蛋白作为动物蛋白的合成来源。但此过程也会产生大量的温室气体。大量基于瘤胃微生物组的研究试图调控瘤胃内微生物发酵过程以达到提升生产效率，降低温室气体排放的作用。但噬菌体作为微生物生态系统中的调控者，其在于瘤胃中的作用还处于研究的空白。

- 摘  要 -

多样的瘤胃病毒组（rumen virome）可以调节瘤胃微生物群落（rumen microbiome），但这一领域仍然上未被深入研究。在这里，我们从975个已发表的瘤胃宏基因组（rumen metagenomes）中挖掘病毒序列，创建了一个全球瘤胃病毒数据库（RVD），并分析了瘤胃病毒组的多样性、病毒-宿主联系以及可能对其瘤胃功能的潜在影响。RVD包含了397,180个种级别的病毒操作分类单元（vOTUs），与IMG/VR V3相比，RVD显著提高了从宏基因组中检测瘤胃病毒的准确性。大多数已分类的vOTUs属于Caudovirales，但与人体肠道中发现的Caudovirales病毒分类上存在巨大差异。瘤胃病毒组会感染核心瘤胃微生物群落，包括纤维降解者和产甲烷微生物，携带多种辅助代谢基因，因此可能以自上而下和自下而上的两种方式影响瘤胃生态系统和功能。RVD和这些研究结果为未来研究病毒如何影响瘤胃生态系统和消化生理提供了有用的资源和理论框架。

- 引  言 -

近期针对多个生态系统（包括海洋病毒、人体肠道和土壤）病毒的宏基因组研究已经生成了大量的病毒基因组目录和数据库。这些研究揭示了极为多样化的病毒组（viromes），识别了大量的辅助代谢基因，并为病毒对生态影响提供了新的见解。此外，以模型系统为焦点的研究已经开始揭示病毒如何通过形成不同的病毒细胞（virocells）来重新编程其原核宿主的代谢，从而改变宿主的生态适应性和代谢。越来越多的证据支持病毒对海洋生物地球化学、人体生理和疾病状态的潜在影响。然而，尚无类似的瘤胃病毒或专门针对瘤胃的病毒数据库的研究。

瘤胃是一个多样的生态系统，其中包括细菌、古菌、真菌、原生生物和病毒。总体而言，瘤胃微生物群落消化和发酵哺乳动物无法消化的高纤维植物成分，以此为反刍动物提供大部分所需的能量（以挥发性脂肪酸的形式）。同时生成的可代谢的氮（以微生物蛋白质的形式）提供反刍动物所需的氨基酸。尽管早期研究使用电子显微镜记录了形态各异的噬菌体，并发现Caudovirales占主导地位。同时早期的基于病毒培养的研究发现了能感染广泛种类或菌株的瘤胃细菌的噬菌体。但早期探索瘤胃的病毒相较于瘤胃中存在的病毒多样性而言，只占了很小的一部分。

于此同时基因组学、宏基因组学和转录组学已成为研究病毒组的主要技术，其中包括瘤胃病毒组。然而，现有的参考基因组数据库没有充分地代表瘤胃病毒，这限制了它们的识别、分类和宿主预测。之前的几项研究虽然已经发现了具有多样基因型的瘤胃病毒，但由于缺乏与参考病毒序列的匹配，大多数病毒没有被分类。最近基于病毒分析的生物信息学工具（例如，CheckV、VirSorter2和VIBRANT）以及日益增加的病毒基因组资源（例如，efam）大大促进了从宏基因组序列中识别病毒，并且提供了可扩展的病毒分类。这些工具使得开发大型生态特异性病毒数据库和全面的全球病毒研究成为可能。

利用新的生信技术，我们分析了近1000个来自五大洲的多种家养和野生反刍动物的宏基因组数据集中的20TB序列数据并分析了其瘤胃病毒组。我们开发了一个系统性编目的瘤胃病毒数据库，其中包含近40万个种级别的vOTUs。并探索了核心瘤胃病毒组，预测了可能被识别出的病毒感染的细菌、古菌和原生生物，并推断了瘤胃病毒通过其携带的辅助代谢基因（AMGs）和抗微生物抗性基因（ARGs）可能起到的生态作用。RVD相较于NCBI RefSeq Viral和IMG/VR V3记录的瘤胃病毒的多样性，增加了>12倍。RVD将被用作一个新的社群资源，为未来关于瘤胃病毒组及其在饲料消化、微生物蛋白质合成、饲料效率和甲烷排放方面的影响提供新的见解。感染瘤胃原虫和甲烷菌病毒或噬菌体可用于控制这两类微生物以提高氮的利用效率和降低甲烷排放。

- 主要发现 -

为填补上述空白，研究团队收集了跨五个大陆，八个国家，十三个反刍动物物种的975个宏基因组序列（图1a），对其病毒序列进行了系统地识别，分类与宿主预测，并建立了全球第一个瘤胃病毒组数据库（RVD）。

图1a：瘤胃病毒组数据库的样本来源

基于RVD，研究团队对瘤胃病毒组的多样性，系统分类，与生态功能进行了研究并由此得出以下结果：

① 

该数据库包含了397，180个vOTUs。我们能够将1,857个vOTUs（占总数的0.47%）归类为属于现有属（genera），以及32,934个vOTUs（占总数的8.3%）归类为属于现有科（families）。大多数可分配到属和科的vOTUs（98.4%）被归类为Siphoviridae、Myoviridae或Podoviridae，这些都属于Caudovirales目，这也是人体肠道病毒组中最丰富的科。与一个系统发生树（图2c）相比，人体和瘤胃病毒组只共享了Caudovirales的14%的属级分类单元，反映了这两种病毒组之间的差异。剩余的vOTUs（占总数的91.7%）不能被分配到任何现有的属或科，因此它们代表新的谱系。此外，还识别出121个vOTUs（占总数的0.03%）为类似crAss的病毒。RVD还包含原生动物病毒（或内源性病毒元素，EVEs），其中一些被分配到Phycodnaviridae、Mimiviridae和Retroviridae。一些瘤胃病毒预测将感染瘤胃古菌（因此是古菌噬菌体）。尽管宏基因组主要由dsDNA组成，我们还识别了109个vOTUs为ssDNA病毒，全部被分配到Microviridae科。稀释分析表明，更多的瘤胃病毒仍有待识别。

图2c: 基于系统发育树的瘤胃尾病毒与人肠道尾病毒的比较

② 

预测宿主对于理解病毒在生态系统中的潜在角色非常重要。通过预测已识别的瘤胃病毒的可能宿主，我们识别出了2403个古菌噬菌体（archaeophages）和40,881个细菌噬菌体（bacteriophages）。这些古菌噬菌体预计将感染25个古菌属，而细菌噬菌体则可以感染1051个细菌属，包括一些具有生态重要性的物种，如Methanobrevibacter（例如，M. ruminantium、M. millerae）、Fibrobacter（例如，F. succinogenes）、Prevotella（例如，P. bryantii, B. ruminicola, P. multiformis）、Ruminococcus（例如，R. albus、R. callidus、R. flavefaciens）和Streptococcus（例如，S. equinus）。令人惊讶的是，有很高比例的细菌噬菌体（9214个，占22.5%）和古菌噬菌体（396个，占16.5%）预测将感染多个宿主物种。此外，这些广宿主范围的瘤胃噬菌体中有3.8%（1544个）可以感染跨越多个细菌门（phyla）的物种（图3a）。相比之下，只有0.13%的人体肠道噬菌体具有广泛的宿主范围。因此病毒对于微生物组的进化，和跨物种的基因传播具有重要潜在影响（图3a）。

图3a：40,881个瘤胃 vOTUs的潜在宿主信息（基于基因组的1，051个细菌属的系统发育树）

③ 

仅通过搜索完整的病毒基因组（vMAGs, 总共5912个），我们发现了286个携带多于一个AMG的vMAGs。这些AMGs代表了41个不同的类别，其中包括在以前的研究中已经识别的36个，以及5个在其他病毒组中尚未识别的（图4a）。这5个新的AMG类别每个都由多于两个的vMAGs携带。它们编码涉及多种代谢过程的酶，包括核苷酸、碳水化合物、维生素和氮的代谢。值得注意的是，最普遍的AMG编码了DNMT1，一种DNA（胞嘧啶-5）-甲基转移酶，该酶可保护病毒免受其宿主的抗病毒限制-修饰系统的影响，并存在于100多个vMAGs中。这与在海洋病毒组中发现这种类型的AMG的高普遍性相符。这样的AMG可能代表了瘤胃病毒的反防御机制。除了直接增加宿主核苷酸代谢以有利于病毒复制外，一些病毒使用AMGs通过促进宿主对营养物质的获取，以间接提高病毒生存。有趣的是，在瘤胃病毒组中发现的所有5个新AMGs都与营养物质的获取和生物合成有关。特别是，vMAGs中发现的几个AMGs编码了糖苷水解酶（GHs），包括参与饲料纤维消化的重要酶GH16和G114（图4b），以及介导氨同化成天冬氨酸的天冬氨酸合成酶。此外，我们还发现了与维生素B12（即钴胆素酶CobS基因）和芳香族氨基酸合成（即异构酮突变酶基因）有关的AMGs。在vMAGs中，我们没有发现编码纤维素酶的AMGs，但在不完整的病毒序列中找到了两个编码纤维素酶的AMGs：一个是GH5，另一个是GH9。在大肠杆菌中对这两个AMGs进行克隆和表达表明，它们编码具有水解羧甲基纤维素功能的纤维素酶（见图4c、d）。通过提供多样且独特的AMGs，瘤胃病毒可能增加宿主对营养物质的获取或重新编程重要的宿主代谢途径（图4e）。

图4：瘤胃病毒组编码独特的辅助代谢基因

④ 

在总共705,380个病毒序列中，我们找到了24个携带抗性基因（ARGs，由至少两个病毒结构基因包围）的病毒序列。仅有少量瘤胃病毒编码ARGs。然而，我们发现了几个主要的ARG类别，包括tet(W)和tet(O)，这两者在瘤胃微生物组中都非常普遍且高度表达。从同一群体的三个不同样本中的识别的三个携带ARG的病毒序列被发现携带相同的ARGs（van(G)和van(W-G)， 并显示出几乎相同的基因组结构（见图5b），这指向了瘤胃病毒作为一种ARG在动物之间传播的可能途径。然而，考虑到识别出的携带ARG编码的噬菌体数量有限，缺乏农场抗生素使用数据，以及即使相应的抗生素没有被使用，识别出的ARGs可能仍然存在于瘤胃生态系统中的可能性，未来还需要进行更多的生态研究以进一步探索病毒作为ARG传播途径的可能性。

图5：由瘤胃病毒基因组编码的抗生素抗性基因

- 总结与讨论 -

环境和人体肠道中的病毒具有极大的多样性，其潜在的生态影响也越来越受到关注和认可。尽管反刍动物瘤胃微生物组中的病毒也被认为是多样的，并且其可能影响瘤胃微生物组和主要的瘤胃功能，但我们对瘤胃病毒仍知之甚少。通过挖掘大部分已发表的瘤胃宏基因组（近1000个），我们识别了近40万个vOTUs，并创建了全球首个瘤胃病毒数据库，即RVD。该数据库大大扩展了当前反刍动物瘤胃病毒的基因组数据，并对其多样性和潜在影响提供了新的见解。作为一个专门针对瘤胃生态系统的数据库，RVD极大地便利和改进了从宏基因组序列中对瘤胃病毒的检测、识别和分类，以及更好地预测病毒与宿主之间的关联。它将是未来瘤胃病毒组研究中的一个有用资源。RVD 也能帮助研究人员更全面的分析瘤胃微生物组：细菌，古菌，原虫 和它们的噬菌体 。

然而，如稀释分析所示，RVD仍不完备。仍有大量的瘤胃病毒多样性未能被覆盖。比如具有较小基因组（<5 kb）的病毒，包括单链DNA（ssDNA）病毒。由于ssDNA病毒在VLP宏基因组中因为尺寸过滤和DNA扩增而富集，因此采用该病毒宏基因组采样方式将有助于在未来的研究中捕获具有较小基因组的病毒和ssDNA病毒。其次，RNA病毒具有RNA基因组，因此除非它们是内源性病毒元素，否则很少能通过宏基因组或病毒宏基因组检测到。正如在海洋和土壤病毒研究中所示的高度丰富的RNA病毒，RNA病毒在瘤胃生态系统中也可能具有高度的多样性。事实上，唯一使用宏转录组学进行的瘤胃RNA病毒研究获得了2466个独特的RNA病毒片段，这些被分配到了九个病毒家族。对已发表和未来的瘤胃宏转录组的全面分析将能够识别瘤胃RNA病毒。第三，因为只有少数几个瘤胃真菌的基因组存在于数据库中，所以我们没有关注真菌病毒。随着未来更多的瘤胃真菌基因组，瘤胃中的真菌病毒可以被识别。尽管数据库需要改进，但RVD对于分析宏基因组和VLP富集宏基因组中的瘤胃病毒数据是一个有用的资源。此外，这些数据对于病毒分类、α-和β-多样性及丰度的分析，以及病毒与宿主关联的预测至关重要。

除了检测、识别和分类外，预测宿主到物种或属级别对了解病毒在任何生态系统（包括瘤胃生态系统）中的生态角色是至关重要的。我们实现了对古菌噬菌体（>2400个）和细菌噬菌体（>40,000个）到物种级别的宿主预测，其中许多宿主物种在饲料消化、发酵和甲烷排放方面发挥着重要作用。宿主和病毒-宿主关联预测的进展将有助于了解瘤胃病毒的生态角色。与之前关于人体肠道中病毒组的研究相符，我们发现了可能感染多个物种，甚至不同门类的物种的瘤胃病毒。事实上，此前的研究发现了一个可以感染11个不同的细菌属的瘤胃病毒。有趣的是，与人体肠道中的病毒相比，更多的瘤胃病毒可能有更广泛的宿主范围。这种差异可能源于瘤胃（由于动物种类/遗传和饮食的大变化）比人体肠道具有更多样化的微生物组和更复杂的生理条件。噬菌体通过转导，从而使宿主的基因库多样化，导致菌株水平的异质性和微生物适应和演化。感染跨越系统分类界限的多样宿主的噬菌体表明了它们促进宿主演化的潜力。然而，与其他研究一样，瘤胃病毒的宿主仅基于DNA序列相似性进行预测。仍需要实验验证来确认特定的瘤胃病毒的宿主。

通过破坏纤维降解细菌和影响生物膜的形成，瘤胃病毒组可能以自上而下的方式影响饲料的可消化性。同样地，通过溶解其宿主细胞并增加可供蛋白水解细菌降解的微生物蛋白量，瘤胃噬菌体可能会促进瘤胃内微生物蛋白的内部循环，这减少了微生物蛋白流向小肠和反刍动物中的氮利用效率。因此，瘤胃病毒组可能也以自上而下的方式影响反刍动物的瘤胃， 包裹微生物蛋白供应，从而影响氮利用效率。

噬菌体对细菌的感染可以导致不同的病毒细胞状态，从而改变宿主的新陈代谢、生理和生态。其中一个潜在机制是为宿主提供与营养获取以及宿主新陈代谢有关的辅助代谢基因（AMGs）。在其他生态系统中，已发现AMGs影响几个重要的生态过程，包括全球碳循环、海洋中的氮代谢，以及环境和人体肠道中的硫代谢。从286个完整的病毒基因组中，我们识别出41类AMGs，包括5个新类别，这极大地扩展了瘤胃生态系统中已知的病毒AMGs的数量，远超过之前在肉牛和麋鹿中报告的少量AMGs。我们发现了编码纤维素酶的AMGs（GH5和GH9），并且证明它们编码功能性纤维素酶。考虑到尚未进行AMG注释的大量不完整的病毒片段，以及尚有其他病毒需要被识别，瘤胃病毒AMGs的实际数量可能比目前揭示的要大几个数量级。尽管如此，识别到的涉及抗病毒防御（例如，DNMT1）、多糖消化（例如，GHs）、氨基酸和维生素生物合成（例如，精氨酸合成酶和钴盐螯合酶CobS）的AMGs。基于瘤胃病毒组也可以以自下而上的方式影响饲料的可消化性和微生物蛋白的合成，未来的研究有必要确定瘤胃病毒组是如何以及在何种程度上影响饲料的可消化性和氮利用效率的。

人体肠道微生物组和病毒组的研究主要关注疾病相关的生理反应。瘤胃微生物组和病毒组的研究主要集中在它们与饲料效率和甲烷排放之间的关联。大多数宏基因组学研究主要关注瘤胃细菌、甲烷原核生物、原生动物和真菌，但由于缺乏参考数据库和用于识别和分类来自瘤胃宏基因组的病毒序列的生物信息学工具，瘤胃病毒/噬菌体通常被忽视。如上所述，瘤胃病毒可以多角度地从自上而下和自下而上的方式影响瘤胃微生物组、主要的瘤胃功能和动物生产性能，包括饲料转化效率和生长和泌乳性能。有了瘤胃病毒数据库，未来的宏基因组学研究可以分析瘤胃微生物组和病毒组，以更好地了解它们在饲料效率和动物生产性能方面的作用和关联，以及提升生产效率降低环境影响。此外，通过识别感染不良瘤胃微生物（如链球菌属、瘤胃甲烷原核生物和原生生物）的噬菌体和相应的酶，瘤胃病毒在减少瘤胃酸中毒、甲烷排放和氮排放方面具有研究潜力。

- 第一作者 -

俄亥俄州立大学

严鸣

博士生

严鸣，俄亥俄州立大学博士生，主要从事宏基因组学与生物信息学的研究。近两年以第一作者在Nature communications, Critical Reviews in Food Science and Nutrition等期刊上发表论文4篇，以共同第一作者在Science of the total environment发表论文一篇。

- 通讯作者 -

俄亥俄州立大学

于忠堂

教授、博士生导师

于忠堂，美国俄亥俄州立大学教授、博士生导师。Microbiome、Journal of Dairy Science等杂志编辑。研究方向包括家畜肠道微生物与环境微生物生态学研究和生物质废弃物转化的微生物学基础研究等。在The ISME Journal、PNAS和Microbiome等刊物发表文章200余篇，所发文章被引用超过19000次。

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