项目文章 | CUTTag助力解析水稻白叶枯病菌Sigma因子70 RpoD的致病作用

发表单位：南京农业大学和江苏省农业科学院植物保护研究所

期      刊：Journal of Integrative Agriculture（IF:4.8）

发表日期：2023年10月18日

2023年南京农业大学和江苏省农业科学院植物保护研究所研究团队在期刊Journal of Integrative Agriculture（IF:4.8）发表了题为“Sigma factor 70 RpoD contributes to virulence by regulating cell motility, oxidative stress tolerance, and manipulating the expression of hrpG and hrpX in Xanthomonas oryzae pv. Oryzae-”的研究论文。该研究结果表明：σ70因子RpoD在植物病原菌相当保守的。在水稻白叶枯病（Xoo）中，PXO_RpoD在氧化应激耐受性和细胞运动中发挥重要作用，也是全面毒力所必需的。此外，CUT&Tag分析表明，RpoD通过调节hrpG和hrpX来调节T3SS。进一步验证表明RpoD直接与hrpG和hrpX启动子结合。爱基百客为该研究提供CUT&Tag技术支持。

研究背景

水稻白叶枯病菌(Xoo)是水稻白叶枯病的主要病原菌，其导致水稻减产，造成重大经济损失。Xoo感染产生各种毒力因子来克服宿主的先天免疫并促进感染。另一方面，细菌Sigma(σ)因子是一种高度特化的蛋白，它使RNA聚合酶识别并结合特定的启动子。σ70因子还调节与应激反应和毒力相关的基因表达。然而，RpoD在Xoo中的作用仍然不清楚。

研究思路

 研究结果

1. RpoD在革兰氏阴性菌中保守

在Xoo PXO99A基因组中，PXO_rpoD(PXO_RS03190)编码区全长1875bp。PXO_rpoD编码一个由624个氨基酸组成的蛋白质——RNA聚合酶sigma 70因子——RpoD。

为了研究RpoD在Xoo中的功能，首先将Xoo RpoD蛋白与Xanthomonas sp.和E.Coli.的RpoD蛋白进行序列比对。BLASTP结果表明，Xoo RpoD蛋白与E.Coli RpoD蛋白有59%的序列相似性。

PXO_RpoD的C-末端含有一个可能的螺旋-转角-螺旋（hth）DNA结合基序，该基序直接接触sigma(70) 依赖的启动子的-35元件(图1A)。PXO_RpoD结构类似与E.Coli RpoD(PDB：41k1)类似。结构比对表明，两个蛋白质的共同残基个数为542个，且具有近似的折叠(图1B)。系统发育分析表明Xoo_RpoD和Xoc_RpoD在Xanthomonas中属于同一簇(图1C)。此外，Xoo_RpoD与另外25株革兰氏阴性菌的RpoD蛋白序列在进化树上表现出高度的进化相似性。Xoo_RpoD与Campylobacter jejuni的RpoD蛋白序列具有共同的祖先来源。这些结果表明，RpoD在革兰氏阴性菌中非常保守。

图1. Xanthomonas RpoD基因的鉴定、序列特征及系统发育分析

2. PXO_rpoD基因敲除导致毒力缺失

为了探讨ΔPXO_rpoD毒力下降是否与其生长能力有关，NB和XOM3培养基上的生长试验表明 PXO_rpoD不是Xoo生长所必需的。

使用WT菌株 PXO99A、衍生突变体ΔPXO_rpoD和互补菌株对易感水稻‘IR24’进行致病力测定 (图2A)，结果表明，ΔPXO_rpoD感染后的平均病变长度为明显短于对照组。互补菌株的毒力部分则恢复到野生型水平 (图2B)。

作者进一步研究WT菌株、ΔPXO_rpoD和CPXO_rpoD菌株在植物中的生长情况。接种后，细菌菌落形成单位数量随着时间的推移而增加。与WT相比，ΔPXO_rpoD在水稻叶片上的细菌数量显著减少，通过互补几乎进行了挽救 (图2C)。

综上所述，这些结果表明，PXO_RpoD对于Xoo的全部毒力是必不可少。

图2. PXO_rpoD基因敲除导致水稻百叶枯病菌毒力下降

3. CUT&Tag 分析揭示RpoD对毒力相关基因的调控作用

细菌σ70因子通过与目标基因的启动子区域结合来激活基因转录。为了确定PXO_RpoD在Xoo中的转录调控作用，使用CUT&Tag研究与毒力相关靶基因。GO富集分析表明，327个特异峰和侧翼基因属于三大功能类别，即生物过程、细胞成分和分子功能(图3)。值得注意的是，PXO_RpoD在Xoo细胞的各种生物学过程中发挥着关键作用，特别是在代谢过程、对刺激的反应和生物调节中。此外，PXO_RpoD对几乎所有的细胞成分都有贡献，包括膜、细胞器、胞外区和核。研究结果还表明，PXO_RpoD 可能具有催化、转录调控和抗氧化活性。总而言之， PXO_RpoD 对细胞成分具有重要作用，并可能作为一个转录调节因子来调节生物学过程。

图3. CUT&Tag分析差异富集峰和侧翼基因的GO注释和分类

4. RpoD参与Xoo的氧化应激耐受

细菌σ70因子在应激反应等生理过程中发挥重要作用。为了验证这一假设，作者研究了Xoo中PXO_rpoD的缺失是否会影响其对过氧化氢氧化应激的耐受性。结果表明，ΔPXO_rpoD比WT和CPXO_rpoD对H2O2氧化应激更敏感(图4A)。ΔPXO_rpoD的平均抑菌圈直径为4.1±0.3 cm，显著大于WT。然而，互补菌株的抑制区直径为3.0±0.2 cm，表明CPXO_rpoD已基本恢复到WT的H2O2氧化胁迫耐受性水平(图4B)。

这些结果表明，PXO_RpoD参与了Xoo对氧化应激的应答。

 图4. RpoD 缺失影响 Xoo 的氧化应激耐受性

5. PXO_rpoD基因缺失影响Xoo鞭毛运动

RpoD通过调节Xcc中FleQ、rpoN2(σ54)和flgM(抗Sigma因子)的表达，参与鞭毛的生物合成和细菌的运动。

因此，作者评估了WT PXO99A、ΔPXO_rpoD和互补菌株在半固体平板上的运动能力。结果表明，ΔPxO_rpoD的运动能力显著小于WT（图5A）。0.6%琼脂平板上，突变菌株的swarming zone显著减少。然而，互补菌株的运动能力几乎恢复到野生型水平(图5B)。本研究结果表明，PXO_rpoD在Xoo细胞运动中起一定作用。

图5. PXO_rpoD缺失影响Xoo的运动能力

6. PXO_RpoD通过HrpG/HrpX调节因子影响T3SS表达

为了进一步探索哪些毒力相关基因受RpoD的调控，作者鉴定了显著富集峰和相关的TSS。有趣的是，研究发现hrpG/X启动子峰的信号比野生型菌株更显著富集(图6A)。位于 hrpG/X 启动子区域和p-value之间的基序富集如图6B，C 所示。对hrpG和hrpX启动子区域进分析发现了RpoD的典型转录元件，包括hrpG的−35(TCGCAA)和−10(GTTGCAATG)盒，以及hrpX的−35(TTGACA)和−10(GCTGCATA)。

为了验证 hrpG/X 的转录水平是否由 RpoD 控制， qRT-PCR 检测WT，PXO_ rpoD 突变体和互补菌株的 hrpG/X的转录水平(图6D)。结果表明，结果表明ΔPXO_rpoD 中 hrpG/X 的相对表达水平显著低于 WT ，而互补菌株中 PXO _ hrpG/X 的相对表达水平几乎恢复到WT水平。此外，T3SS分泌效应子 XopP 在 ΔPXO _ rpoD 中的转录水平显著下调。

有趣的是，PXO_rpoD 的敲除抑制了烟草中 Xoo 触发的植物细胞程序性死亡 (图6E) ，这表明 PXO_ RpoD 参与T3SS的调节。使用电解质渗漏分析进一步验证了细胞死亡的差异（图6F）。与野生型和互补株相比，ΔPXO_rpoD的电解质渗漏率显著降低，缺失T3SS的ΔPXO_hrcU为阴性对照。综上所述， PXO_RpoD 通过调节 hrpG/X 的转录在 Xoo 的完全毒力中起关键作用，随后导致 T3SS 及其相关效应物的表达。

图6. RpoD通过调控hrpG和hrpX的转录调控T3SS

7. PXO_RpoD直接与hrpG和hrpX的启动子区域结合

为了测试转录调控基因PXO_RpoD和hrpG/X启动子区域之间的相互作用，采用细菌单杂交系统来测试RpoD和PXO_hrpG/X启动子之间的潜在直接互作。结果表明，同时含有pTRG-rpoD和pBXcmT-PXO_hrpG/X的菌株在选择培养基上生长良好，与阳性对照相似。然而，在相同的条件下，阴性对照未能生长(图7A)。这表明PXO_RpoD与hrpG/X启动子在体内发生了直接的物理互作。

为了进一步研究PXO_RpoD与hrpG/X之间的相互作用，用EMSA体外验证PXO_RpoD与hrpG/X启动子区域的结合。p-hrpG/X DNA片段的迁移率变化表明RpoD可以直接与p-hrpG/X结合形成RpoD-p-hrpG/X复合体(图7B)。此外，随着PXO_RpoD蛋白浓度的增加，移位的结合复合体条带逐渐变强。这表明，PXO_RpoD与hrpG/X启动子的相互作用导致转录水平的提高。

图7. RpoD与hrpG和hrpX的启动子区域结合

结  语 

该研究中作者鉴定了σ70因子PXO_RPOD序列的特征。致病力分析表明，PXO_RpoD是Xoo全毒力的必需因子。CUT&Tag分析表明，PXO_RpoD参与了应激反应和细胞运动。进一步的研究证实，RpoD直接与hrpG和hrpX的启动子区域结合，进而调控T3SS相关基因和效应因子。总而言之，这些发现不仅表明保守的σ70因子PXO_RpoD作为转录调节因子正向调节T3SS，而且还在Xoo毒力涉及的运动性和氧化应激耐受方面显示出新的作用，这为疾病控制的潜在靶点提供了新的见解。

图8. RpoD介导Xoo毒力调控模型

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