本文主要是介绍杨树愈伤遗传转化,希望对大家解决编程问题提供一定的参考价值,需要的开发者们随着小编来一起学习吧!
参考文献
Wen SS, Ge XL, Wang R, Yang HF, Bai YE, Guo YH, Zhang J, Lu MZ, Zhao ST, Wang LQ. An Efficient Agrobacterium-Mediated Transformation Method for Hybrid Poplar 84K (Populus alba × P. glandulosa) Using Calli as Explants. Int J Mol Sci. 2022 Feb 17;23(4):2216. doi: 10.3390/ijms23042216. PMID: 35216331; PMCID: PMC8879841.
一、主要步骤:
1、愈伤诱导
2、共培养
3、筛选抗性芽(芽诱导)
4、生根筛选
二、主要两种方法:
1、愈伤诱导和侵染同时进行;
2、先愈伤诱导14-20天,再剥离愈伤进行侵染。
三、主要培养基
1、愈伤诱导(CIM):WPM+0.1mg/L KT+1mg/L 2,4-D
2、共培养(CM):WPM+20g/L Sucrose+0.5g/L MES+100uM AS
3、筛选抗性芽(SIM):WPM+0.05mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA
4、生根筛选(RM):1/2 MS+30 g/L sucrose+5 g/L agar+0.05 mg/L IBA + 0.02 mg NAA
四、抗性浓度:Hyg 1-1.5mg/L, timentin 200mg/L
五、菌液浓度:OD600=0.4-0.6
六、侵染液制备方法
1、离心收集菌体,用重悬液重悬得到侵染液;
2、直接在菌液中加AS获得侵染液。
七、文章具体步骤(先愈伤诱导14-20天,再剥离愈伤进行侵染)
七、其他改良方法
(一)卢孟柱(愈伤诱导和侵染同时进行)
1、摇菌的OD600为0.6,离心后用重悬液重悬得到OD600=0.3的侵染液;
2、将叶片划出伤口后置于侵染液中15min;
3、将侵染叶片用滤纸吸干菌液后,倒置铺在共培养培养基上,暗培养1~3天;
4、在低浓度筛选培养基中暗培养到愈伤组织长出;
5、在高浓度筛选培养基中暗培养愈伤组织生长至0.5~1.0cm(两周继代一 次);
6、转移至含有载体抗性对应的抗生素的分化培养基上;
7、待不定芽生长至1-2cm后,切下转移至含有载体抗性对应的抗生素组合的生根培养基上。
每升用量 | 重悬液 | 共培养基 | 筛选培养基 | 分化培养基 | 生根培养基 |
基础培养基 | WPM | WPM | WPM | WPM | MS2.215g |
MES | 0.5g | 0.5g | 0.5g | 0.5g | - |
蔗糖 | 20g | 20g | 20g | 20g | 10g |
琼脂/植物凝胶 | - | 琼脂7.8g | 凝胶5g | 琼脂7.8g | 琼脂7.8g |
2,4-D | 1.0mg/L | 1.0mg/L | 1.0mg/L | - | - |
KT | 0.1mg/L | 0.1mg/L | 0.1mg/L | - | - |
葡萄糖酸钙 | 0.65g | 0.65g | 0.65g | 0.65g | - |
肌醇 | 0.1g | 0.1g | 0.1g | 0.1g | - |
6-BA | - | - | - | 0.5mg/L | - |
NAA | - | - | - | 0.04mg/L | - |
TDZ | - | - | - | 0.02mg/L | - |
IBA | - | - | - | - | |
头孢霉素 | - | - | 200mg/L | 200mg/L | 200mg/L |
特美汀 | - | - | 300mg/L | 300mg/L | 300mg/L |
潮霉素B | - | - | 1.5mg/L-2mg/L | 1.0mg/L-1.5mg/L | 1.5mg/L |
AS | - | 100uM | - | - | - |
pH | 5.6 | 5.9-6.0 | 5.9-6.0 | 5.9-6.0 | 5.9-6.0 |
(二)中科院(愈伤诱导和侵染同时进行)
1、摇菌的OD600为0.4-0.6,离心后用重悬液重悬得到OD600=0.3的侵染液;
2、将叶片划出伤口后置于侵染液中15min;
3、将侵染叶片用滤纸吸干菌液后,倒置铺在共培养培养基上,暗培养2天;
4、在低浓度筛选培养基中暗培养到愈伤组织长出;
5、在高浓度筛选培养基中暗培养愈伤组织生长至0.5~1.0cm(两周继代一 次);
6、转移至含有载体抗性对应的抗生素的分化培养基上;
7、待不定芽生长至1-2cm后,切下转移至含有载体抗性对应的抗生素组合的生根培养基上。
每升用量 | 重悬液 | 共培养基(WPMC) | 筛选培养基(WPMS) | 分化培养基(WPMD) | 生根培养基(MS0) |
基础培养基 | WPM | WPM | WPM | WPM | MS 2.3g |
MES | 0.5g | 0.5g | 0.5g | 0.5g | 0.5g |
蔗糖 | 20g | 20g | 20g | 20g | 10g |
琼脂/植物凝胶 | 凝胶5g | 凝胶5g | 凝胶5g | 琼脂7g | |
2,4-D | 1.0mg/L | - | 1.0mg/L | ||
KT | 0.1mg/L | - | 0.1mg/L | ||
6-BA | - | - | 0.5mg/L | ||
NAA | - | - | 0.05mg/L | ||
头孢霉素 | - | 200mg/L | 200mg/L | 200mg/L | |
特美汀 | - | 200mg/L | 200mg/L | 200mg/L | |
潮霉素B | - | 1.0mg/L 2.0mg/L | 1.5mg/L | 1.5mg/L | |
AS | 100uM | ||||
pH | 5.6 | 5.9-6.0 | 5.9-6.0 | 5.9-6.0 | 5.9-6.0 |
(三)自己实验室( 先愈伤诱导14-20天,再剥离愈伤进行侵染)
1、愈伤生长
(1)去掉叶柄,叶柄可以留下生长愈伤,并在叶片主脉上横向划出2-3道伤口正面朝下平铺在愈伤培养基(WPMY)上,25℃暗培养;
(2)叶片生长二三十天后,将愈伤分成黄豆粒大小(小块的可以拼凑成大块)放入新的愈伤培养基(WPMY)继续生长;
(3)使用时提前放入共培养基(WPMC)中。
2、摇OD600为0.5
3、侵染与共培养
(1)3500rpm离心10 min ,倒掉上清液,加入等体积的重悬液,轻轻晃动使菌体重悬,于25℃,50转/分钟振荡培养1-2h。
(2)浸染15 min后,待愈伤表面菌液吹干后,放置在共培养基(WPMC)上,在25℃下暗培养共培养60-70h
4、筛选培养
(1)在超净台上,将暗处理后的叶片转入特美汀浓度分别为100mg/L、0mg/L的洗菌液中,从高到低分别冲洗5min,然后放置于灭完菌的滤纸上吹干;
(2)再转移到有筛选压(真核抗性)和脱菌(特美汀终浓度为200mg/L)分化培养基(WPMS)上,进行筛选培养,光照周期(光照16h/黑暗8h),温度25℃。
(3)在不定芽长到半公分左右后,使用无菌的镊子或者手术刀切下有不定芽(注意观察不定芽的生长点,避免选同一细胞分化的不定芽),放到芽伸长培养基中。
5、生根筛选
不定芽长到1-2厘米时,使用无菌的镊子或者手术刀将不定芽单个切下,并放入生根培养基(1/2MS0)上进行生根培养。
八、总结
(一)共同之处
1、愈伤诱导的培养基都是:WPM+0.1mg/L KT+1mg/L 2,4-D;
2、共培养的培养基都是:WPM+20g/L Sucrose+0.5g/L MES+100uM AS。
(二)不同之处
1、卢孟柱课题组的基础培养基加了肌醇和葡萄糖酸钙。其中共培养基和分化培养基没有用凝胶,但是凝胶会影响出芽率,所以建议都改成凝胶;
2、中科院分化培养基没有TDZ,但TDZ是有利于出芽的,所以推荐有TDZ的配方。
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