本文主要是介绍mNGS应用推荐:HL-SAN耐高盐核酸酶,高效去除宿主DNA,希望对大家解决编程问题提供一定的参考价值,需要的开发者们随着小编来一起学习吧!
描述
无论是实验室规模样品制备、还是生产规模工艺过程,去除核酸都可以改善工艺流程,如蛋白纯化、病毒载体制备、mNGS中样品处理等过程。而核酸酶的选择,就显得特别重要。Heat Labile-Salt Active Nuclease (热不稳定性耐高盐核酸酶,HL-SAN) 是一种非特异性内切酶,在高盐浓度下具有最佳活性;且该酶在多种缓冲液中都有活性,很容易通过还原剂处理而失活。这些特性使HL-SAN在需要去除DNA和RNA的应用中,更为适合。
核酸污染,特别是宿主基因组DNA污染,在几乎所有工艺流程及生物制品的生产中,都是需要重点解决的问题。一方面,宿主DNA的存在,影响目标产物的纯化及下游质量分析等。另一方面,宿主DNA残留能引起机体严重的免疫反应,是生物制品的关键质量参数之一,FDA及NMPA等对Host Cell DNA (HCD)有严格的质控要求。
宿主基因组DNA中,组蛋白与DNA形成核小体,核小体紧密折叠形成结构复杂的染色质。组蛋白与DNA间存在强烈的离子作用及疏水作用,再加上特殊的结构,导致宿主DNA很难被准确检测并清除。已有文献表明,高盐浓度下组蛋白与DNA解离相对彻底,这有利于宿主DNA的检测及去除。但市售的绝大多数核酸酶在高盐浓度下活性很弱,甚至完全失活。而耐高盐的HL-SAN成了这类应用的理想选择。
推荐应用
1. 病原微生物诊断应用,如宏基因组测序(mNGS)样品去除宿主DNA;
2. 蛋白纯化,特别是DNA结合蛋白;
3. 其他需要去除宿主DNA的应用等。
优势
1. 高盐条件下,宿主DNA去除更彻底;
2. pI为9.6,容易跟绝大多数蛋白分离;
3. 还原剂存在时,酶易失活,减少对后续流程的影响。
使用指导
1. DNA去除方案
从细胞抽提物或细胞裂解液中去除DNA污染,HL-SAN的使用量受到多种因素影响,如细胞类型、裂解液组成、NaCl浓度、Mg2+浓度、裂解液pH等。参考方案见Figure 1。比如,对于1ml细胞裂解样品,调整到0.3-0.75 M NaCl浓度,加入1000 U HL-SAN,15℃-37℃温度条件下孵育30-60min,或者4℃过夜。Mg2+是必须的。
Figure 1. 不同样品、不同去除要求下,HL-SAN的推荐浓度及反应条件。(DNA removal的要求是指通过琼脂糖凝胶电泳看不到条带。Decontamination的去除要求是对23S rDNA进行qPCR检测为阴性。)
2.灭活
灭活是通过添加还原剂(TCEP或DTT)来实现的,推荐用TCEP(因为TCEP在磷酸盐溶液中不稳定,特别在中性pH下)。不同工艺流程中,通过改变孵育时间、温度和还原剂的浓度等来灭活该酶。一般情况下, 25-37℃反应5-10分钟,可以灭活99%以上的酶。为了避免酶恢复活性、再次激活,保持低浓度还原剂,如0.1-0.5 mM DTT或TCEP,或延长灭活反应时间。
Figure 2. HL-SAN的灭活反应条件。
应用实例:
高效去除人体DNA (99.99%)干扰、快速检测下呼吸道感染(LRIs)病原
呼吸道感染(RIs)病原的快速检测一直是医疗中亟待解决的问题。RIs样本类型众多并且病原含量差别很大,同时带有大量的人体细胞,因此搭建一套快速、高效的样本处理系统对于通过高通量测序进行病原检测至关重要。
2019年Nature Biotechnology文章报道了如下流程。为了尽可能去除宿主DNA、提高检测灵敏度,在优化实验的人体宿主细胞去除、微生物DNA提取和nanopore测序等三个步骤都做了对应的优化,比如宿主DNA去除时找到了合适浓度的saponin (2.2%),HL-SAN步骤由两步减为一步,清洗步骤缩减为2次。最终,从拿到样本到建库完成缩短至6hr,且在最终检测中达到了96.6%的敏感性和100%的特异性。
Figure 3. Nanopore宏基因组快检流程。
酶学特征
来源:Pichia pastoris
酶比活:≥1.75 x 10^5 Units/mg
酶活定义:在37℃,25mM Tris-HCl,pH8.5 (25℃),5mM MgCl2,500mM NaCl反应体系中,一个单位的HL-SAN在30分钟内消化50µg/ml的小牛胸腺DNA(Sigma, D-1501),产生OD260nm处1A的吸光值变化。
特异性:非特异性内切核酸酶,能够将单链及双链的DNA及RNA,消化成5个碱基为主的寡核苷酸oligos。
酶活条件:(Effective是指活性在最优活性10%以上的条件范围)
References
1. Nanopore metagenomics enables rapid clinical diagnosis of bacterial lower respiratoryinfection. Charalampous T, Kay GL, O’Grady J. Nature Biotechnology. 2019;37: 783–792.
2. A Structured Workflow for Mapping Human Sin3 Histone Deacetylase ComplexInteractions Using Halo-MudPIT Affinity-Purification Mass Spectrometry. BanksCAS, Thornton JL, Washburn MP. Molecular & Cellular Proteomics. 2018;17 (7): 1432-1447.
3. Recombinant expression and purification of an ATP-dependent DNA ligase from Aliivibriosalmonicida. Williamson A, Pedersen H. Protein Expr Purif. 2014; 97: 29-36.
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