Scientific Reports：前额叶经颅直流电刺激对意识障碍患者干预作用的行为学和电生理证据

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在急性昏迷阶段后，严重的急性脑损伤可导致持续的意识障碍(DOC)。昏迷恢复量表修订(CRS-R)是用于区分植物人/无反应清醒状态综合征(VS/UWS)与最小意识状态(MCS)患者最广泛使用的工具。VS/UWS只表现出无目的的反射行为，MCS表现出可重复但不一致的认知和有意识的皮质调节行为。然而，这种行为评估方法存在局限性，15-20%的VS/UWS患者表现出的大脑活动模式或表明了具有更高的意识状态。在各种不同的脑成像技术中，脑电图已被证明是一种非侵入、可靠的且价格低廉的简便工具，可用于探查DOC患者的意识状态和对外界刺激的意识响应特征。特别地，在脑电的分析方法中,频带中谱功率、复杂度和功能连通性的增加与意识状态相关，将行为学和脑电图相结合来评估在治疗期间可能的意识改善似乎更佳。
最近，经颅直流电刺激(tDCS)已显示出改善DOC患者意识状态的潜在益处(CRS-R评估)，然而，一些研究者却没有发现tDCS后意识的改善,因此，人们对tDCS的有效性仍然存在争议。这种怀疑主要是由于其改善机制尚未完全建立，而且大多数报告行为结果的研究并没有调查tDCS对大脑神经活动的影响。尤其在DOC患者中，tDCS对脑电活动的影响仅仅进行了小样本研究。由于测量方法的多样性和缺乏关于意识电生理学的明确的基本假设，使得研究者很难解释tDCS对病患意识恢复的影响。
近期，来自法国的研究团队在Nature子刊《Scientific Reports》杂志发表题为《Combined behavioral and electrophysiological evidence for a direct cortical effect of prefrontal tDCS on disorders of consciousness》的研究论文。在该研究中，研究者通过结合行为学和电生理学结果评估了前额叶tDCS(图1A)对意识恢复的影响,以研究tDCS对意识障碍患者干预作用及其神经机制。

研究方法
在这项研究中，研究者的主要目标是根据行为学结果来评估tDCS对脑电图(EEG)的影响。为了做到这一点，研究者设计了评估方案,即在单次tDCS之前和之后立即进行了行为学评估和电生数据记录,具体的:(1)刺激前的行为学评估，(2)刺激前的脑电记录；(3) 20分钟tDCS刺激；(iv)刺激后的脑电记录；(v)刺激后行为学评估(图1A)。关于tDCS刺激参数和用于行为学和电生理评估的细节如下，但在这里需要注意的是，刺激后评估是在大约45分钟到1小时内完成的;考虑到单次tDCS对皮层兴奋性的影响至少持续1小时，且据报道有更持久的行为效应，该设计允许研究者捕捉刺激后的电生理和行为学效应。
1.经颅直流电刺激(tDCS)。该刺激包括在左背外侧前额叶皮层处进行单次20分钟2 mA的开放式tDCS刺激。阳极置于左侧背外侧前额叶皮层，阴极置于右侧额叶上皮层(国际脑电图10-20系统分别为F3和Fp2)。使用Neuroelectrics starstim 8系统，通过盐水浸泡的25平方厘米圆形海绵电极进行刺激，在整个刺激过程中，阻抗保持在10 kΩ以下。
2.行为学评估。采用临床金标准昏迷恢复量表(CRS-R)对意识状态进行评估，该量表对一组按层次顺序排列的项目进行反应的存在与否评估，这些项目包括听觉、视觉、运动、运动、交流和唤醒功能。CRS-R既是定量的(得分范围从0到23)，也是定性的，一些关键行为定义了不同的意识状态(昏迷、VS/UWS、MCS或exit-MCS)。刺激后CRS-R评分较刺激前CRS-R评分升高(R+)，而CRS-R评分无变化或降低(R-)，是对tDCS反应的先验定义。所有的CRS-R均由训练有素的医师在当天同一时间(上午结束时)进行，每个病人都由同一位医生进行评估。。
3.脑电数据记录。为了评估tDCS的电生理效应,研究者记录了5分钟静息状态和听觉oddball的ERP范式的脑电数据，该听觉oddball范式源于先前发表的范式，旨在引起对听觉新奇的自动(错配负性MMN和P3a)和有意识(P3b)信号检测。脑电记录的硬件设备使用了NetAmps 300放大器和基于高密度海绵的256通道HydroCel，记录时的采样率设置为250Hz，阻抗低于100 kΩ。

图1行为学实验及结果

研究结果
1.tDCS后的行为学结果：在2015年10月至2018年9月期间，69名符合条件的DOC患者中，66名患者接受了单次20分钟tDCS治疗，阳极位于左前额叶背外侧皮层，阴极位于右眶上皮层，使用的参数与之前在DOC患者中报道的相同。本次tDCS的效果通过行为学和电生理数据评估进行评估，该评估使用的是静息态和刺激前后的听觉oddball范式中的CRS-R和高密度脑电图记录。
其中60例被纳入本研究(1例昏迷，1例脑电图发作，4例后续分析脑电图数据不完整。因此，包括24例VS/UWS、32例MCS和4例exit-MCS患者。其中12例患者(20%)观察到刺激后CRS-R评分较刺激前增加:4例VS/UWS(16.7%)，7例MCS(21.9%)和1例exit-MCS(25%)，无组间差异(p>0.8)。3例患者出现意识状态改变，1例VS/UWS移向MCS, 2例MCS移向exit-MCS(图1B,C),所有患者的CRS-R评分都没有下降。总的来说，刺激后的CRS-R评分变化明显大于0 (p=0.002)。R+和R−人群在人口统计学特征(年龄、性别、病因和受伤后的时间)方面没有显著差异，更重要的是，在tDCS前他们的数据和数据预处理方面也没有显著差异。
2.相较于R-患者，R+患者的theta-alpha波段的频谱功率和连通性增加
研究者使用刺激前\后5分钟的脑电图来分析静息状态脑活动与tDCS刺激后的行为反应之间的相互作用。
功率谱密度：刺激后，与R−相比，R+表现出显著的归一化theta频段能量增加，且在顶叶头皮上最大(图2)。同样，研究者观察到原始归一化alpha频段能量的增加，其它频段谱功率在R−和R+之间没有差异。

图2静息态的脑电特征

复杂度：用theta-alpha频段的排列熵评估脑电图复杂性，发现在同一顶叶区域，R+较R−有增加的趋势。

功能连通性：R+患者也表现出theta-alpha频段(4-10 Hz)功能连接的增强。加权符号互信息捕获了电极对之间的线性和非线性耦合，能评估功能连接的增加。在比较平均脑电图时，研究者发现，与R-患者相比，R+患者有一个增加的顶枕群(p=0.01, 图2)。R+与R-患者之间的这些差异可以解释为：刺激后R+患者较刺激前增加，而R-患者无明显变化(图3B)。研究者还发现，R+和R−在delta-theta频段(2-5Hz)和alpha-beta频段(8-20Hz)的功能连接上没有差异。值得注意的是，在比较VS/UWS患者与MCS和exit-MCS患者时，tDCS的效果并没有出现显著的差异。

图3 Alpha-theta频段的功能连接

2.相较于R-患者，R+患者的听觉诱发神经信号提升了
除了静息态脑电活动，研究者还评估了tDCS对患者听觉诱发电位的影响。患者被要求在5个相同的音调序列中(标准试验占实验总试次的80%)，主动地计数随机产生的听觉异常试次(4个相同的音调，接着是第5个不同的音调，占实验总试次的20%)。在tDCS前\后，研究者将事件相关电位(ERP)计算为偏差音减去标准音，并使用与静止状态相同的相互作用对比来比较R+和R-。其中5个患者的脑电图记录数据在质量自动评估后被丢弃，对剩下的55个数据集(11个R+患者和44个R-患者)进行分析后发现，在第5个音调开始后28 ms至376 ms有一个显著的正左偏前聚类(p=0.008, 图4A)，前后比较将这种效应的起源定位于R+患者中两个显著的聚类(第一个后侧聚类来自52-312ms, p= 0.03；第二个左偏前聚类来自68-392 ms, p=0.02)。尽管在刺激后观察到的ERP反应在第5个声调之后就开始了，但它在时间上是持续的，并在典型的P3a成分的200毫秒左右达到峰值，这表明对听觉新奇性的高级处理。R+在刺激前仅出现经典失配负性MMN,相比之下，R-患者无差异(图4B)。
为了更好地描述ERP独立于其空间分布的动态特性，研究者在单变量分析的基础上加入了多变量时间综合译码方法和基于聚类的排列分析。这在涉及脑损伤患者的研究中尤其有用，在这些研究中，由于受试者之间的空间变异性，经典ERP成分的识别可能会失败。在R+组和R-组患者中，译码能力的提高与R+组和R -组患者译码能力的提高存在显著差异(两个显著性聚类，p=0.002和p=0.04,图4 C)。R−患者在tDCS记录前后比较时未显示出任何显著性聚类，R+患者的试验组译码有显著的增加，对应于两个延迟且持续的聚类(第5次音调后~300-600 ms;两个p < 0.04;图4D)。值得注意的是，在tDCS之后解码性能的提高呈现出一个方形形状，在泛化矩阵上从大约300ms增加到600ms，这表明在这个时间窗口中存在潜在的亚稳态大脑活动，唤起了对后期P3b信号的有意识访问对听觉新奇的违反。
综上所述，研究者的研究结果表明，虽然R+组表现出一个显著的效应，包括P3晚期对违反听觉规律的有意识的信号，但无论是用单变量方法还是用多变量方法，R-组都没有检测到这种反应。


图4 tDCS响应患者有意识听觉刺激的神经信号增强

3.相较于R-患者，R+患者的被识别为MCS的概率增加
除了单变量方法外，研究者还评估了tDCS的行为学反应是否与意识状态的多变量脑电图预测的改善有关。为此，研究者使用支持向量机分类器和68个静止状态脑电图特征(98例患者(75VS/UWS和67 MCS)单变量标记的时间和空间平均值和功能)来区分VS/UWS和MCS。对每一个病人tDCS之前和之后研究者计算了分类MCS的预测,使用重复测量因子设计的非参数分析，以MCS预测为因变量,行为反应作为被试之间的因素(R+ vs R−),和刺激作为被试内的因素(tDCS前vs tDCS后)。虽然没有观察到刺激或行为学反应的主要影响，但存在行为学反应相互作用的显著刺激(p=0.045)。检验后显示，R+患者在tDCS后MCS预测显著增加(中位差异为5.0% ，p=0.01），R−患者未发现任何影响(中位差异为2.5%，p=0.32)。
4.电生理反应与前额皮皮层的电场强度相关
为了评估这种脑电图活性的增强是否由tDCS特异性，如果是，又是通过何种机制，研究者接着研究了脑电图变化与tDCS诱导电场之间的关系。
tDCS的作用机制已被提出，包括调节神经元的兴奋性和对突触可塑性的影响。这两种机制在体外和体内动物实验中都得到了明确的证明，它们是由外加电场引起的神经元膜的极化所驱动的。这种极化随电场强度呈线性增加，因此可以合理地假设电场强度对神经功能规模的影响。有人担心，传统的协议在场强方面足以影响神经回路，最近也有一些观点认为，经颅刺激的效果可能是由于周围神经的激活，特别是头皮感觉的激活，这些观点已经得到了很好的证明。由于外周神经的膜极化，这些外周效应也随电场的大小而变化。为了确定刺激在人群中可能的作用机制，以及皮层效应和外周效应的比较，研究者分析了大脑和头皮电场与脑电图效应之间的相互关系。
为此，研究者根据现有的T1加权MRI (n= 47)，估计tDCS诱导的整个头部电场。然后，研究者将不同患者的电场与脑电图效应的前后差异联系起来。对于脑电图，研究者使用前一节中描述的意识状态的多变量预测器。相关分析仅限于平均电场可能产生生理效应的区域如> 0.5 V/m。在多次比较中幸存的正相关区域包括靠近刺激电极的左背外侧和眶上前额皮质(r= 0.433, p= 0.007，排列试验)，而负相关仅局限于邻近头皮(r=−0.432,p=0.036，排列试验，图5)。结果表明，更强的额叶皮层区域改善了脑电图的意识神经标记。
图5.电生理反应与电场强度的关系

结论
在这项研究中，研究者描述了单次左背外侧前额叶皮层tDCS的行为学和电生理反应。研究者首先证明，行为学上意识的改善与静息状态假定标记的增加有关，同时还出现了听觉新奇的有意识获取的神经特征。然后,研究者将这些电生理变化与tDCS联系起来，电生理反应与前额皮质电场呈正相关，而头皮电场与之呈负相关。
尽管该研究属于开放性实验设计，缺少对照组，但相关的研究结论仍然能够支持tDCS的临床干预效果。首先，研究者发现该研究中R+患者的占比与前人的随机对照试验结果没有显著差异。其次，tDCS干预后的患者的反应率远远高于相关文献介绍的患者自发康复反应率。第三，没有观察到任何R-患者的CRS-R评分下降，但是患者的自发康复的评分波动往往是双向的,评分可能下降也可能上升。当然,这也有可能是因为两次评分的时间间隔太短(小于2小时)限制了一些其他因素对实验结果的影响。最后最重要的是,行为反应与增强的脑电图神经信号之间的联系以及前额皮质电场与这种客观的电生理反应之间的相互关系都暗示了tDCS对大脑功能的直接因果影响。在经颅电刺激研究中，使用这种客观的、定量的脑活动测量是必不可少的，这不仅是因为它可以研究行为与认知功能之间的因果关系以及tDCS的作用机制，还因为合适的标准假刺激程序似乎很难甚至不可能实现。
该研究结果是令人鼓舞的，因为它提供了更多的证据，支持了tDCS在DOC患者治疗中的效果，同时提供了一个通过调节皮层活动和皮质间连接性来改善意识的机制。

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