IDT公司CRISPR基因编辑技术解决方案

美国Integrated DNA Technologies公司（简称IDT），总部位于美国爱荷华州科勒尔维尔，成立于 1987年，是基因组学领域开发的领先者，也是公认的定制核酸生产行业的领导者。

IDT 凭借在 DNA 合成领域的领导能力，为基因组学应用开发了专有技术，例如下一代测序、CRISPR 基因组编辑、合成生物学、数字 PCR 和 RNA 干扰。通过 GMP 服务，IDT的产品被科学家用于研究多种癌症以及大多数遗传性和传染性疾病。

IDT为100多个国家和地区的超过120,000名生命科学研究人员提供服务，每天生产70,000多条核酸产品。

2020年11月3日，北京泽平科技与美国Integrated DNA Technologies（以下简称”IDT”）达成战略合作。泽平科技成为美国Integrated DNA Technologies公司代理商。根据协议，泽平科技将代理销售IDT公司CRISPR基因组编辑等板块的产品及业务。

关于Alt-R® CRISPR 基因编辑系统

IDT公司 Alt-R® CRISPR 基因编辑系统。该系统主要采取的转化核糖蛋白复合物（Ribonucleoprotein complex，RNP）的方法，RNP 即 Cas9 蛋白和 gRNA 结合形成的具有编辑功能的复合物。

IDT公司 Alt-R® CRISPR 基因编辑系统。该系统主要采取的转化核糖蛋白复合物（Ribonucleoprotein complex，RNP）的方法，RNP 即 Cas9 蛋白和 gRNA 结合形成的具有编辑功能的复合物。

3 步组装「分子改造器」：

Alt-R® CRISPR 系统的实验操作只需 3 步，就像把大象放进冰箱一样简单！

IDT Alt-R® CRISPR/Cas9 实验流程

IDT 同时也提供针对不同模式生物的 protocol，相信总有一款适合你！

IDT Alt-R® CRISPR 相关实验流程

优化的「螺纹钉」

在 IDT Alt-R® CRISPR 系统中，组成「螺纹钉」gRNA 的「零件」crRNA 和 tracrRNA 均经过了特殊优化。天然 tracrRNA 较长，含 89 个碱基，合成复杂且费用较高。优化后的 67 个碱基的通用型 tracrRNA，可与特异的 crRNA 在体外结合形成 gRNA。36 个碱基的 crRNA 包括结合靶序列的结构域（含 20 个碱基）和结合 tracrRNA 的结合域（含 16 个碱基）。

IDT 通过实验证明 36 碱基的 crRNA 和 67 碱基的 tracrRNA 组合效率最高。且二者均添加了特殊化学修饰，可使 gRNA 具有核酸酶抗性。为便于追踪和筛选被成功转化的细胞，可在 tracrRNA 中添加荧光基团修饰。

你只需要提供符合要求的 20 个碱基靶序列即可下单 crRNA，搭配 IDT 公司的通用 tracrRNA 和 Cas9 蛋白，只需要稍加组装，即可成为直入基因组靶区腹地的神器。

不过值得一提的是，与其他 CRISPR/Cas9 方式相比，RNP 的细胞毒性低、不易引起免疫反应，且在体外即可对 DNA 片段进行切割，便于在预实验中初步验证「分子改造器」的效率。

IDT Alt-R® CRISPR/Cas9 系统组成:

利用 Alt-R CRISPR-Cas9 系统阳性对照crRNA组成的RNP在体外对柱纯化 Hs HPRT 扩增产物进行编辑。

体外基因编辑的体系为 10 μL，Sample1 为对照组，只含 Hs HPRT 基因编辑模板不含RNP；Sample 2 包含模板和 RNP。随后利用片段分析仪进行编辑效率分析。

如图所示，IDT 在线工具提供针对人、大鼠、小鼠、斑马鱼、线虫等多种模式生物的预设计 crRNA 序列库。用户只需选择物种和输入基因名即可获取预设计位点。

IDT crRNA 在线设计工具

如果预设计库中没有针对靶目标的「螺纹钉」，你可以输入 Fasta 序列进行定制设计并利用在线「crRNA 检查器」（CRISPR-Cas9 crRNA Checker）排查潜在的脱靶位点。IDT 在线工具凝结了很多科学家实践多年的心血，在设计层面充分把控了脱靶风险。

降低脱靶率的「扳手」

干细胞移植专家，美国斯坦福大学,马修•波特斯（Matthew Porteus）博士说：

“人类干细胞上的测试结果表明，与其他高保真 Cas9 酶比，IDT 的 Alt-R® S.P. HIFI Cas9 呈现出稳定的中靶编辑活性，脱靶率又极低。我们被这个高保真的 Cas9 酶的表现所折服，已在使用它来开发基于基因编辑的疾病治疗方案。”

波特斯博士所提的在人类干细胞测试中胜出的高保真 Cas9 酶，为 IDT 科学家通过对 250 000 个 Cas9 突变体筛选后，优化出的 Alt-R® S.P. HIFI Cas9 酶。众所周知，CRISPR 基因编辑的脱靶效应是其作为医疗用途的潜在隐患。而Alt-R® S.P. HIFI Cas9 蛋白则特别适合脱靶效应敏感的应用环境该酶使 CRISPR 系统成为更精确的基因组编辑工具。

如下图所示，Alt- R® HIFI Cas9 蛋白与 Kleinstiver 等人发表的 SpCas9-HF1 （Kleinstiver et al., Nature 529:490-495）以及 Slaymaker 等人发表的 eSpCas9（Slaymaker et al., Science 351:84-88）在脱靶率上的表现高度一致：即相比普通的野生型 Alt-R® S.P. Cas9 蛋白，对 EMX1，HEKSite4 或 VEGFA3 基因编辑的脱靶效应显著降低；同时，Alt-R® HIFI Cas9 蛋白的有效切割效率与野生型接近。

Alt-R® S.P. HIFI Cas9 可保证靶向编辑效率的同时又无脱靶现象

Alt- R 普通野生型 Cas9 （深蓝色）、Alt-R HIFI Cas9 （橙色）、SpCas9-HF1 （浅蓝色）、eSpCas9（灰色）4 种蛋白分别与靶向 EMX1，HEKSite4 或 VEGFA3 基因的 Alt-R gRNA 结合形成 1 μM RNP复合物。利用 Lipofectamine RNAi MAX 转染试剂将 10 nM 的 RNP 分别转染到 HEK-293 细胞系。48 小时后提取基因组 DNA 进行切割率分析。

目前，IDT Alt-R® CRISPR 系统及 Alt-R® S.P. HIFI Cas9 酶的优越性已得到许多实验室的认可，广泛应用于各种细胞、小鼠、斑马鱼、植物等系统中。

另外，IDT 还提供 Alt-R® CRISPR-Cas12a (CPF1)系统 ，为不能被CRISPR-Cas9 体系编辑的区域提供新的 CRISPR 目标位点。该系统中，Alt-R® A.s. Cas12a (Cpf1) 酶可识别 PAM 序列 TTTV。该系统使在生物体内编辑富含 AT 碱基区域的基因组成为可能。

IDT Alt-R® CRISPR-Cas12a 系统组成

IDT Alt-R® CRISPR 系统被多篇发表在高质量期刊的文献所引用

部分使用 IDT Alt-R® CRISPR 发表在 Nature、Neuron 等期刊上的文章：

Riddle MR, Aspiras AC, et al. (2018) Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature, 555 : 647–651.

Luo L, Bokil N, et al.. (2017) SCIMP is a transmembrane non-TIR TLR adaptor that promotes proinflammatory cytokine production from macrophages . Nat Commun, 8 : 14133.

Agudelo D, Duringer A, et al.. (2017) Marker-free coselection for CRISPR-driven genome editing in human cells. Nature Methods, 14 :615–620.

Mikheikin A, Olsen A, et al. (2017) DNA nanomapping using CRISPR-Cas9 as a programmable nanoparticle. Nat Commun, 8 : 1665.

Kohler S, Wojcik M, et al.. (2017) Superresolution microscopy reveals the three-dimensional organization of meiotic chromosome axes in intact Caenorhabditis elegans tissue . Proc Natl Acad Sci USA, 114 : E4734–E4743.

Seki A, Rutz S. (2018) Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. J Exp Med. doi: 10.1084/jem.20171626

Quadros RM, Miura H, et al. (2017) Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins . Genome Biology, 18 : 92.

Han X, Liu Z, et al. (2017) Cas9 ribonucleoprotein delivery via microfluidic cell-deformation chip for human T-Cell genome editing and immunotherapy . Adv Biosys, 1 : 1600007.

Andersson M, Turesson H, et al. (2018) Genome editing in potato via CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein delivery. Physiol Plant. doi: 10.1111/ppl.12731

Brinkman EK, Kousholt AN, et al. (2018) Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Res. doi: 10.1093/nar/gky164

Kim KW, Tang NH, et al. (2018) A neuronal piRNA pathway inhibits axon regeneration in C. elegans. Neuron, 97 : 1–9.

Al Abdallah Q, Ge W, Fortwendel JR. (2017) A simple and universal system for gene manipulation in Aspergillus fumigatus: in vitro-assembled Cas9 guide RNA ribonucleoproteins coupled with microhomology repair templates. mSphere, 2 : e00446–17.

di Pietro F, Valon L, et al.. (2017) An RNAi screen in a novel model of oriented divisions identifies the actin-capping protein Z β as an essential regulator of spindle orientation. Curr Biol, 27 : 2452–2464.

除了以上的「扳手」和「螺纹钉」，针对整个编辑流程 IDT 还提供下列试剂为你的基因编辑保驾护航：

1. Alt-R® Genome Editing Detection Kit

可用于快速检测 CRISPR 的编辑效率；

2. Alt-R® CRISPR-Cas9 Electroporation Enhancer

可用于提高难转化细胞系的电转效率。