分光光度法的基础知识

分光光度法是基于测量溶液中物质对光的选择性吸收程度而建立起来的分析方法，主要包括比色法、紫外及可见分光光度法、红外光谱法。那么，分光光度法困扰我们的最常见问题是什么呢？

分光光度法的特点

有色物质对光的吸收具有选择性。它呈现的颜色与被吸收的光线的颜色互为补色，如果要确定某种溶液选择吸收的特定波长一般可以先用UV扫一下，确定最大波长，也可以根据实际试样通过查文献来确定最大波长。

表1 物质的颜色和吸收颜色的关系

对任何一种有色溶剂，都可以测定出它的吸收光谱，UV的分光精度越高，作出的光吸收曲线的精度越高，光吸收程度最大处的波长也就是最大吸收波长。溶液浓度不同时，光吸收曲线的形状相同，其最大吸收波长不变，只是吸光度大小不同。我们在测定时一般用最大吸收波长作为测定波长。如图1所示：不同浓度高锰酸钾溶液的吸光度不同，但是最大吸收波长都是在525nm。

图1 不同浓度的高锰酸钾溶液在400-650nm　波段的定性扫描吸收光谱图

另外，吸光度具有加合性，在某一入射波长下，溶液中含有多种对光产生吸收的物质，那么该溶液对该波长光的吸光度A总应等于溶液中每一种成分的吸光度之和。这一性质对多组分的测定极为有利。

分光光度法的基本原理

ε用来衡量显色反应的灵敏度，ε越大则该反应越灵敏。ε是有色化合物在一定波长下的特征常数，它取决于有色化合物本身的性质及其对光选择吸收的能力，而与溶液的浓度和厚度无关。这也是我们在实验过程中选选显色剂的依据。

朗波-比尔定律虽然是进行定量分析的依据，但也是有一定的使用范围的，有一些情况会使其失效，其适用范围如图2所示，导致朗波-比尔定律失效的原因如下：

(1)入射的光不是单色光。

比尔定律的前提就是入射光为单色光，但实际上现在所用的仪器很难做到纯单色光，而一般得到的都是在一定波长范围的复合光。比较好的UV得到的单色光纯度就会比较好，其所得的测量线的线性范围就越宽，偏离比尔定律就比较小。

(2)由于化学变化引起的失效。

在进行显色反应时，有时因为形成不同的络合物，以及缔合物的电离、溶剂化、互变异构等现象的存在都会引起有色化合物浓度的变化，而使工作曲线发生弯曲变化。

(3)由于介质的不均匀性而引起的失效。

一些小的企业实验室可能会用到标准样换算法，采用这种方法要注意的问题是：

(1)工作曲线通过原点。

(2)工作曲线呈直线。

(3)试样中待测组分的含量与标准样品的含量相接近，且待测试样的组成与标准样品的组成相类似。

显色反应及其影响因素

在实际试验中怎么处理溶液中共存离子的影响？

消除共存离子的途径主要有以下几个方法：

（1）利用掩蔽剂消除干扰。

（2）控制溶液的酸碱度。

（3）利用氧化还原反应改变干扰离子的价态，也是消除干扰的有效办法。

（4）控制显色条件消除干扰。

（5）利用校正系数消除干扰。

（6）采用适当的分离方法。

提高实验准确度需要怎样的测试条件？

（1）选择合适的测量波长。

（2）选择适当的参比溶液。通常利用分光光度计透光率为100%作为测量相对标准的溶液叫做参比溶液。

我们在实验过程中的参比要人如何选择？

（4）褪色空白。

当试样基体有颜色，显色剂也有颜色，单一使用试样空白或者试剂空白都不可行，在此情况下，如能寻找到一种褪色剂，有选择性的将被测离子络合或改变它的价态，使显色的有色物质褪色，以此来作为参比溶液，可同时消除有色试剂和有色共存离子的干扰。

不显色空白。有些显色反应，当所用试剂的加入顺序发生变化时就不会显色，这样配制的空白溶液含有试样基体和试剂的颜色，但被测离子有没有显色，简称为不显色空白。可消除试样溶液颜色的干扰。

（5）平行操作空白。

在微量或精确分析中，为了消除所用试剂颜色的影响以及在操作过程中可能引入的极微量被测离子的影响，可用不含被测离子的试样或不称样，其余的和正常测样的试验流程一样操作，简称平行操作空白。

（6）控制适当的吸光度度数范围。

从图2可以看出在A=0.434时光度误差最小，透光度在20%-65%读数，其光度误差是比较小的。因此为了控制适当的范围内读数（吸光度在0.2-0.8），在实际工作中，可根据待测组分浓度的高低，选择合适的称样量、稀释倍数、显色体积以及比色皿的厚度等，来控制有色溶液的吸光度读数。

图2.光度误差与吸光率的关系图

图3.参比液的选择原则

分光光度计

分光光度计的基本结构都是由光源、分光系统、吸收池、检测器和测量信号显示系统5个基本部分组成。一般有双光束和单光束两种类型。

分光光度计的一般检测项：

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分光光度计