ELISpot常见疑难问题解答，以及相关试剂盒研究

本文主要是介绍ELISpot常见疑难问题解答，以及相关试剂盒研究，希望对大家解决编程问题提供一定的参考价值，需要的开发者们随着小编来一起学习吧！

酶联免疫斑点实验 (enzyme linked immunospot assay, ELISpot) 是一种在96孔板内的一百万个细胞中实现对单个分泌细胞进行定量检测的新型的免疫酶技术。灵敏度高，易操作，成本相对流式细胞术较低，已被广泛应用于癌症研究，疾病探索以及疫苗研发等领域。

ELISpot原理：将细胞置于包被有特异性抗体的96孔板中培养，在有刺激的条件下，细胞分泌的细胞因子或免疫球蛋白会被包被抗体捕获。移除细胞后，被捕获的细胞因子可进一步使用生物素标记的二抗来标识，其后再与酶标记的亲和素作用，并加入底物使其呈色，有反应作用的细胞会留下直径大小不等的染色斑点。

常见疑难问题解答：

1.推荐哪种ELISpot板子？

建议使用PVDF膜的96孔ELISpot板子，有效结合大量捕获抗体，前提是膜用乙醇预处理（即活化）。

2.板的颜色是否重要，我应选择白色板子还是透明板子？

白色和透明ELISpot板具有相同类型的PVDF膜。这两种颜色在读板仪中略有不同，但并不重要。（如果有没有添加液体的漏掉的孔，透明的板子很容易看见。）

3.包被前为什么要用乙醇对ELISpot板进行预处理？

ELISpot板子的膜具有多孔疏水结构。为了使大量捕获抗体能够结合，应该用乙醇处理膜以使其亲水。这是获得高质量斑点所必需的致密抗体包被层。ELISpot板子的逐步预包被和EtOH处理的protocol。

4.冷冻细胞可以用于ELISpot吗？

冷冻保存的细胞非常适合ELISpot。然而，其结果取决于细胞的质量，必须建立冷冻/解冻的程序以产生具有高活力的细胞。标准冷冻程序应包括使用DMSO和胎牛血清或类似物，并逐步冷冻程序。

5.在ELISpot中每孔使用多少个细胞？

必须将每个孔中的细胞数量调整为细胞类型和分泌细胞的预期频率。如果频率非常低，例如10,000个细胞中的1个，则需要更多数量的细胞，通常约250,000个细胞/孔。当分泌细胞的频率高时，例如10个细胞中的1个，约5,000个细胞/孔就足够了。细胞数量在测定中并不总是显示线性，因为需要细胞-细胞的zui佳接触，例如抗原呈递细胞的充分刺激。当分析抗原特异性T细胞时，PBMC不应低于每孔200,000个细胞。

通常不建议使用超过500,000个细胞/孔，因为这可能产生多个细胞层，反过来由于细胞和ELISpot膜之间的距离增加而导致斑点质量降低。

6.可以在ELISpot中使用人血清吗？

由于以下原因，不建议在ELISpot中使用人血清。当分析人类样品时，感兴趣的分析物（例如IFN-γ或IgG）实际上可能存在于血清中。由于分析物将与捕获和检测抗体结合，因此会导致膜变暗。人血清可能含有嗜异性抗体，其可与来自许多物种的Ig交叉反应。这种反应可能会导致双抗夹心免疫检测中抗体交联的问题。在ELISpot中，它将导致膜的普遍变暗。

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